蛋白质与酶工程酶的分离纯化.ppt

Chapter3TheExtraction SeparationandPurificationofEnzyme 酶的提取与分离纯化 Contentsofchapter3 1 酶的提取与分离纯化技术路线 2 细胞破碎 3 酶的提取 4 酶的分离方法 Go Go Go Go 5 酶的组合分离纯化策略 Go 6 酶的浓缩 干燥与结晶 Go 细胞结构与酶分布 酶的提取 分离纯化 酶的提取 分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出 再与杂质分开 而获得与使用目的 要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程基本原则一 防止变性失效二 可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件三 提取 纯化的每一步都应进行酶活力的检测 3 1酶的提取 分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物 植物或微生物细胞 发酵液 离心分离 过滤分离 沉淀分离 层析分离 电泳分离 萃取分离 结晶分离等 注意点 1 除了少数例外 所有操作都应在低温下条件下进行 尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心2 大多数酶在pH10的情况下不稳定 故必须控制整个系统不要过酸或过碱 同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象 3 酶和其它蛋白质一样 常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性 故操作中应尽量减少泡沫形成 4 重金属 有机溶剂等能使酶变性失效 微生物污染 蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏 所有这些也都应予以足够的重视 3 2细胞破碎许多酶存在于细胞内 为了提取这些胞内酶 首先需要对细胞进行破碎处理 1 机械破碎2 物理破碎3 化学破碎4 酶解破碎 JY92 IID超声波细胞粉碎机 细胞破碎珠 高压细胞破碎机 DY89 I型电动玻璃匀浆机 机械破碎 捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎 温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂 甲苯 丙酮丁醇 氯仿表面活性剂 Triton Tween 酶促破碎 自溶法外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力 使组织 细胞破碎 通过各种物理因素的作用 使组织 细胞的外层结构破坏 而使细胞破碎 通过各种化学试剂对细胞膜的作用 而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用 使细胞外层结构受到破坏 而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理 本章目录 超声波破碎法 利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎 Fig Sonicator 酶的提取是指在一定的条件下 用适当的溶剂或溶液处理含酶原料 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程 也称为酶的抽提 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质 选择适当的溶剂 一般说来 极性物质易溶于极性溶剂中 非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中 酸性物质易溶于碱性溶剂中 碱性物质易溶于酸性溶剂中 酶都能溶解于水 通常可用水或稀酸 稀碱 稀盐溶液等进行提取 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团 则可用有机溶剂提取 3 3酶的提取 提高温度 降低溶液粘度 增加扩散面积 縮短扩散距离 增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度 从而增大提取效果 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活 在提取过程中还要注意控制好温度 pH值等提取条件 酶的主要提取方法 大多数蛋白类酶都溶于水 而且在低浓度的盐存在的条件下 酶的溶解度随盐浓度的升高而增加 这称为盐溶现象 本章目录 影响提取的主要因素 温度温度对酶的提取效果影响明显 适当提高温度 可以增加酶的溶解度和分子扩散速度 但温度过高会引起酶的变性失活 采用有机溶剂时 温度控制在 低温条件下 室温下提取的有酵母醇脱氢酶 细菌碱性磷酸酶 胃蛋白酶 因此在不影响酶的活性条件下 适当提高温度 有利于酶的提取 溶液的 对酶的溶解度和稳定性有显著影响 不同的 酶会带不同的电荷及其带的电荷量不同 酶在等电点的溶解度最低 故提高溶解度应该避开等电点 但不能过高过低 提取液的体积增加提取液的用量 可以提高酶的提取率 过量的提取液会使酶浓度降低 对分离纯化不利 所以提取液总量一般为原料体积的 体积 最好分几次提取 在酶的提取过程中 体积小 颗粒的比表面积大 扩散面积大 有利于提高扩散速度 适当的搅拌和适当的延长时间 可使酶更好的溶解出来 注意为了保护酶的稳定性 可加某些保护剂 如与酶作用的底物 辅酶 某些抗氧化剂 分离方法的选择 为了获得理想的分离效果应注意 工作前应对所要纯化的酶的理化性质 溶解度 分子大小和解离特性 以及酶的稳定性等有一个较全面的了解 判断选择的方法与条件是否适当 始终应以活力测定为准则 要严格控制操作条件 防止变性 3 4酶的分离 酶的分离纯化方法 现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的 性质方法分子大小离心 超离心法 凝胶过滤 膜分离技术 超滤 反渗透 微孔过滤 透析 电渗析等 溶解度盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 结晶电荷或基团离子交换色谱 电泳 等电聚焦 吸附色谱 疏水色谱 聚焦色谱稳定性选择性变性法 热 酸碱 表面活性剂 特殊 专一性结合 亲和色谱 亲和洗脱 亲和电泳 酶的分离方法 1 沉淀分离 2 离心分离 3 过滤与膜分离 4 层析分离 Go Go Go Go 5 电泳分离 Go 6 萃取分离 Go 本章目录 1 沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质 使酶的溶解度降低 而从溶液中沉淀析出 与其它溶质分离的技术过程 盐析沉淀法 盐析法是最古老的 但也是目前仍广泛采用的方法 盐析法根据的原理是 球蛋白在低盐浓度的溶液中 溶解度随盐离子强度升高而增大 表现 盐溶 saltingin 的特性 但是当盐浓度继续升高 并超过某一上限时 其溶解度又会先后以不同速度下降 分别 盐析 saltingout 沉淀析出 盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法 球蛋白溶解度 溶液离子强度关系 盐析 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因 1 中和蛋白质分子表面电荷2 与蛋白质颗粒竞争水分子不同蛋白质表面极性基团 带电数目及分布等不同 因而可以分级沉淀 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点 蛋白质浓度在1mg ml以上 低温 此法优点 简便 安全 重现性好缺点 分辨率低 纯度提高不显著 同时为了下一步纯化 有时还需要脱盐 盐析 盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱法 saltingoutchromatography 即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体 在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附 然后再梯度地降低盐类浓度 使酶和杂蛋白分别洗脱出来 这种技术的优点是纯化量大 重复性好 分辨率高较 盐析 蛋白质和酶在溶液中的溶解度 与溶液中的离子强度有关 Log S S0 KsILogS LogS0 KsI KsIS 蛋白质或酶在离子强度为I时的溶解度 w v S0 蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度Ks 盐析常数I 离子强度 盐析 在一定的温度和pH条件下 为常数 通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离 称为KS分段盐析 在一定的盐和离子强度条件下 Ks I为常数 通过改变温度或pH值使不同物质分离 称 分段盐析 盐析 蛋白质盐析沉淀中 常用的中性盐有硫酸铵 硫酸钠 硫酸钾 硫酸镁 氯化钠 和磷酸钠等 硫酸铵最常用 不同的酶 盐析时所需的盐浓度个不相同 酶的来源 酶的浓度 杂质的成分等对盐析时所需的盐浓度也有所影响 经盐析后的酶沉淀 含有大量盐分 需采用透析 超滤或层析等方法进行脱盐 等电点沉淀法 原理 利用两性电解质在等电点时溶解度最低和不同的电解质具有不同的等电点的特性 通过调节溶液的PH 使酶或蛋白质沉淀析出 从而使酶和蛋白质分离的方法 等电点时 两性电解质分子的静电荷为零 分子间的静电斥力消除 使分子能聚集在一起而沉淀下来 由于在等电点时 两性电解质表面的水化膜依然存在 故实际上酶等大分子蛋白质仍有一定的溶解性 从而使沉淀不完全 在实际中 此法经常与其他方法一起使用 如等电点经常与盐析沉淀 有机溶剂沉淀 和复合沉淀一起使用 单独使用时 主要是从粗酶中除去某些等电点相差较大的蛋白质 加酸碱时 一边搅拌一边慢慢加进 防止局部过酸过碱一起蛋白质变性 等电点沉淀法 如 纯化动物材料抽提液中的酶时 可将pH先调整至5左右 待放置片刻后 核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出 使酶溶液达到 一步澄清 又如 纯化血清胆碱脂酶时 可先将pH先调至2 8 3 0 除去酸性杂蛋白 有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低溶液的介电常数 增加蛋白质分子间的静电引力 导致蛋白质的溶解度下降 也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集 沉淀 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法 应考虑 温度pH离子和离子强度有机溶剂此法优点 分辨率高 溶剂易除去 缺点 温度控制不当时易引起变性 本节目录 有机溶剂沉淀法 用于蛋白质纯化的有机溶剂中 丙酮的分离效果最好 引起失效的情况比较少 除丙酮外 乙醇和甲醇等也常用 有机溶剂浓度通常以百分体积表示 加入量可按下式计算 V Vo S2 S1 S S2 V 应加入的有机溶剂体积Vo 原溶液的体积S2 所要达到的有机溶剂百分浓度S1 原溶液中有机溶剂的百分浓度S 待加有机溶剂的百分浓度 复合沉淀法 定义 在酶液中加入某些物质 使它与酶形成复合物沉淀下来 从而使酶和杂质分离的方法称为复合沉淀法 常用的复合沉淀剂 单宁 聚乙二醇 聚丙烯酸例 菠萝蛋白酶与单宁复合可以制成药片 用于治疗咽喉炎复合物有的可以直接中使用 有的用适当的方法 使酶从复合物中析出进一步纯化 复合沉淀法 利用离子型表面活性剂如SDS 非离子型表面活性剂如聚乙二醇 polyethyleneglycol PEG 聚乙烯亚胺以及单宁酸 硫酸链霉素等 在一定条件下能与蛋白质直接地形成络合物 使蛋白质沉淀析出 然后再用适当方法使需要的酶溶解出来 除去杂蛋白和沉淀剂 从而达到纯化的目的 复合沉淀法 以聚乙烯亚胺 polyethylenimine PEI 纯化限制性内切核酸酶RE EcoRI为例 在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中 包含大量的DNA和杂蛋白 PEI在0 2mol LKCl的条件下 能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出 但当KCl的浓度上升至0 6mol L时 虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态 而RE EcoRI却能重新溶解 因此可将酶和杂蛋白分离开来 使RE EcoRI得到初步纯化 选择性变性沉淀法 定义 选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀 而不影响所需酶的方法 方法 热处理 改变PH或加入某些金属离子应用此法必须对与分离的酶以及酶液中的杂蛋白的种类含量及其物理和化学性质有较全面的了解 本节目录 2 离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力 使不同大小 不同密度的物质分离的技术过程 在离心分离时 要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小 密度和特性的不同 选择适当的离心机 离心方法和离心条件 常速离心机又称为低速离心机 其最大转速在8000r min以内 相对离心力 RCF 在1 104g以下 在酶的分离纯化过程中 主要用于细胞 细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离 也用于酶的结晶等较大颗粒的分离 高速离心机的最大转速为 1 2 5 104r min 相对离心力达到1 104 1 105g 在酶的分离中主要用于沉淀 细胞碎片和细胞器等的分离 为了防止高速离心过程中 温度升高而造成酶的变性失活 有些高速离心机装设有冷冻装置 谓之高速冷冻离心机 超速离心机的最大转速达 2 5 12 104r min 相对离心力可以高达5 105g甚至更高 超速离心主要用于DNA RNA 蛋白质等生物大分子以及细胞器 病毒等的分离纯化 样品纯度的检测 沉降系数和相对分子质量的测定等 实验室离心机 温度类型 常温及冷冻超速离心机均为冷冻型 使用冷冻离心机时提前降温 预冷离心头 开盖关机 使用超速离心机时先抽真空 离心的形式 角式及外摆式 外摆式一般为低速 角式由低速到超速均有 角式离心机和离心头 转子 角式离心头要配套 低温使用要预冷 操作注意稳 盖 旋紧 水平转子旋转时随着转子的转动从垂直悬吊上升到水平位置 约200 800rpm 时 颗粒在水平转子中的沉降是沿管子方向的 离心机的大小 台式 离心机的大小 落地式 离心管 材质 玻璃 塑料强度 和离心速度相配大小 和转子配套高速超速管要加盖 离心机操作 平衡 定温 定速 定时 离心机其它类型 超速冷冻离心机 立式螺旋过滤离心机 活塞推料离心机 碟片式离心机外形 管式离心机 三足离心机 J 30I 高速冷冻离心机 实例1 用途 1 细菌 蛋白沉淀 核酸提取 细胞 亚细胞组份分离 2 动 植物病毒分离 血液血清提取及溶液中大 小颗粒不同组份的分离 操作步骤 1 打开离心机盖 选择容量适合的转子 将带样品离心管放入转子内 样品一定要平衡好 再将转子放入离心室内固定好转子 2 关好离心机盖 设定离心机转子型号 转速 离心时间 温度 启动运转 3 离心时间到待转速降至零 打开离心机盖将样品 离心管 取出 离心结束 方法 差速离心 采用不同的离心速度和离心时间 分离大小和密度相差较大的颗粒 沉降速度离心 区带离心 密度梯度离心 样品在平缓的介质梯度中移动 最小密度大于介质的最大密度 不同物质按沉降速度的大小形成区带 介质为蔗糖 甘油 分离密度相近大小不同的样品 如蛋白 沉降平衡离心 等密度梯度 介质的梯度有适当陡度 最大密度大于样品的最大密度 样品各组分移动到与各自密度相同的位置 介质为CsCl 常用于分离大小相近密度不同的样品 如核酸 2 1密度梯度离心密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心 使沉降系数不同的组分得以分离的一种区带分离方法 密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的 梯度介质应有足够大的溶解度 以形成所需的密度 不与分离组分反应 而且不会引起分离组分的凝聚 变性或失活 常用的有蔗糖 甘油等 使用最多的是蔗糖密度梯度系统 其梯度范围是 蔗糖浓度5 60 密度1 02 1 30g cm3 密度梯度的制备可采用梯度混合器 也可将不同浓度的蔗糖溶液 小心地一层层加入离心管中 越靠管底 浓度越高 形成阶梯梯度 离心前 把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面 离心后 不同大小 不同形状 有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带 各区带内的颗粒较均一 分离效果较好 在密度梯度离心过程中 区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变 随离心时间的加长 区带会因颗粒扩散而越来越宽 为此 适当增大离心力而缩短离心时间 可以减少区带扩宽 2 2等密度离心将CsCl2 CsSO4等介质溶液与样品溶液混合 然后在选定的离心力作用下 经足够时间的离心 铯盐在离心场中沉降形成密度梯度样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形成区带 常用来分离提取核酸 亚细胞器和质粒 前述密度梯度离心法中 欲分离的颗粒未达到其等密度位置 故分离效果不如等密度离心法好 应当注意的是 铯盐浓度过高和离心力过大时 铯盐会沉淀管底 严重时会造成事故 故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度和离心机转速及离心时间 此外 铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性 故最好使用钛合金转子 转子使用后要仔细清洗并干燥 蔗糖密度梯度离心 CsCl等密度梯度离心 离心条件的确定 离心力离心时间温度和pH值 离心力 低速离心一般用转速 即转子每分钟的转数表示 如5000r min 而在高速特别是超速离心时 往往以相对离心力 RCF 表示 如5000g 相对离心力是颗粒所受到的离心力与地心的引力的比值 式中 RCF为相对离心力 g FC为离心力 Fg为地心引力 n为转子每分钟的转数 r min r为旋转半径 cm 颗粒距离离心轴越远 其所受的离心力越大 一般离心力的数值是平均数值 即在离心溶液中点处颗粒所受的离心力 离心时间 对于低速和高速离心机和差速离心来说 离心时间是指颗粒从离心管样品液的液面完全沉降到离心官底的时间 称为沉降时间或澄清时间 对于密度梯度离心而言 离心时间是指形成界限分明的区带时间 称为区带形成时间 等密度梯度离心 是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间 称为平衡时间 其中最常用的是沉降时间 沉降时间 沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离 t表示沉降时间 s s表示颗粒的沉降系数 w表示转子的角速度 rad s r1 r2分别表示旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离 cm 上式子做如下变换k称为转子因子 温度和PH 离心温度一般控制在4 左右 对于某些耐热性较好的酶 也可以在室温下进行离心分离 但在超速离心和高速离心时 由于转子高速旋转会发热而引起温度升高 必须采用冷冻装置 使温度维持在一定范围内 离心介质的PH必须处于酶稳定的PH范围内 必要时可采用缓冲溶液 过高过低可能引起酶的变性失活 还可能引起转子和离心机其他部件的腐蚀 应当加以注意 膜过滤技术 membranefiltration 借助于一定孔径的高分子薄膜 将不同大小 不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术 膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途 甚至会导致一次工业革命的重大生产技术 所以可以称为前沿技术 是世界各国研究的热点 广泛应用于生物工程 化学 制药 饮料 电力 冶金 海水淡化 资源再生等领域 渗出液 3 过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小 不同形状的物质分离的技术过程 膜分离技术的地位和影响 美国官方文件曾说 18世纪电器改变了整个工业进程 而20世纪膜技术将改变整个面貌 目前没有一种技术 能像膜技术这么广泛地被应用 日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研究和开发 谁掌握了膜技术 谁就掌握了化学工业的未来 NormanN Li 美国科学院院士 著名华裔科学家 膜分离已得到广泛应用 21世纪是工业生物技术的世纪 膜技术将扮演重要角色 过滤的分类及其特性 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 过滤 非膜过滤 采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤 采用各种高分子膜为过滤介质 根据过滤介质的不同 非膜过滤 定义 采用高分子膜以外的材料 如滤纸 滤布 多孔陶瓷 纤维 烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤 包括粗滤和部分微滤粗滤 借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2 m的颗粒 使固形物和液体分离的技术 粗滤应用范围 酵母霉菌动植物细胞培养基残渣大颗粒固形物粗滤介质 滤纸滤布纤维多孔陶瓷烧结金属助滤剂 硅藻土活性炭纸粕推动力 常压过滤加压过滤减压过滤 粗滤 常压过滤以液位差为推动力的过滤方法过滤设备简单 操作易行方便 但过滤速度慢分离效果差加压过滤以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力的过滤方法 设备简单 过滤较快 过滤效果好减压过滤又称真空过滤或抽滤 是通过在过滤介质的下方抽真空 增加过滤介质上下方之间的压力差 推动液体通过过滤介质 而把大颗粒截留的过滤方法 微滤 定义 又称微孔过滤 微滤所截留的颗粒直径在0 2 2 m 无菌水 汽水等饮料的生产中广泛应用 一般采用微孔陶瓷 烧结金属等作为过滤介质 也可用微滤膜 借助于一定孔径的高分子薄膜 将不同大小 不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术 膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈 醋酸纤维素 赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜 有时也可以采用动物膜等 膜分离过程中 薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过 而把大于其孔径的颗粒截留 膜的孔径有多种规格可供使用时选择 膜分离 加压膜分离 微滤超滤反渗透 电场膜分离 电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离 透析 膜分离技术 加压膜分离 加压膜分离定义 以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术 分类 以截留颗粒大小 1微滤2超滤3反渗透 一 微滤 MF 又称微孔过滤 是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术 1 截留颗粒直径 0 2 2um 2 操作压力 低于0 1MPa 3 应用 实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵液中的细胞 无菌水 矿泉水 纯生啤酒的生产 热敏性药物和营养物质的过滤除菌等 二 超滤 UF 可截留溶液中溶解的大分子物质 而透过小分子物质 1 截留颗粒直径 2 200nm 2 操作压力 0 1 0 7MPa 3 应用 一是分离纯化 从高分子物质与低分子物质的溶液中 使低分子物质透过膜 二是溶液的浓缩 三 反渗透 RO 在压力作用下 溶剂 通常是水 透过膜 而溶质被阻挡于膜壁外 1 截留颗粒直径 小于2nm 2 操作压力 0 7 13MPa 3 应用 主要用于分离各种离子和小分子物质 在酶液的浓缩 无离子水的制备 海水淡化等方面广泛应用 渗透 反渗透 反渗透 RO 电场膜分离 定义 电场膜分离是在半透膜两侧分别装上正负极 在电场的作用下 带电的小分子或者离子向与它们所带电荷相反的方向移动 透过半透膜达到分离的目的 电渗析电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐 海水淡化 纯水制备以及其他带电荷小分子的分离 用于凝胶电泳后含有的蛋白质或核酸的凝胶带电荷大分子的分离 离子交换膜点渗析与电渗析一样 只是用离子交换膜代替半透膜 电渗析 在电场作用下 带电离子透过膜向两极移动 而达到分离的目的 应用 电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐 海水淡化 纯水制备等 扩散膜分离 定义 利用小分子的扩散作用 不断使小分子透过半透膜扩散到膜外 而大分子被截留 从而达到分离的效果 材料动物膜羊皮纸火棉胶赛璐玢 应用 在生物分离方面 主要用于生物大分子溶液的脱盐 由于透析过程以浓差为传质推动力 膜的透过通量很小 不适于大规模生物分离过程 而在实验室中应用较多 透析 透析 血液透析 膜分离技术的基本流程 渗出液 膜组件 料液罐 浓缩液 回流液 泵 中空纤维超滤器中空纤维膜分离装置是将成束的中空纤维装入一筒内 两端封闭 当轴流通过管腔时 造成高剪切力 在截留溶质分子的同时 将浓度降至最低限度 每根中空纤维内腔直径为0 2mm 中空纤维由惰性的非离子聚合物制成 具有各向异性 抗堵塞性 运用成束纤维表面积大 流量大 阻留溶质的浓度范围 4 一20 左右 如右图 生产中常用的膜分离装置 中空纤维超滤膜组件 膜的结构 膜 表层 孔径各异 厚度为0 1 5um 基层 起支持作用 厚度为50 250um 4 层析分离 层析技术 亦称色谱技术 是一种物理的分离方法 它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别 使各组分以不同程度分布在两个相中 其中一个相为固定的 称为固定相 另一个相则流过此固定相 称为流动相 并使各组分以不同速度移动 从而达到分离 层析分离方法 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法 吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术 吸附剂来源丰富 价格低廉 可再生 吸附设备简单 吸附层析通常采用柱型装置 将吸附剂装在吸附柱中 装置成吸附层析柱 层析时 欲分离的混合溶液自柱顶加入 当样品液全部进入吸附层析柱后 再加入洗脱剂解吸洗脱 在洗脱时 层析柱内不断发生解吸 吸附 再解吸 再吸附的过程 溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法 分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同 而使各组分分离的方法 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时 该溶质在两项溶剂中的浓度的比值 在层析条件确定后 层析系数是一常数 在分配层析中 通常采用一种多孔性固体支持物 如滤纸 硅藻土 纤维素等 吸着一种溶剂为固定相 这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上 另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动 称为流动相 当某溶质在流动相的带动流经固定相时 该溶质在两相之间进行连续的动态分配 纸上层析分配薄层层析分配气相层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团 活性基团 对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质 通过在不溶性高分子物质 母体 上引入若干可解离基团 活性基团 而制成 按活性基团的性质不同 离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂 由于酶分子具有两性性质 所以可用阳离子交换剂 也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化 凝胶层析又称为凝胶过滤 分子排阻层析 分子筛层析等 是指以各种多孔凝胶为固定相 利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术 凝胶层析柱中装有多孔凝胶 当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时 大分子物质由于分子直径大 不能进入凝胶的微孔 只能分布于凝胶颗粒的间隙中 以较快的速度流过凝胶柱 较小的分子能进入凝胶的微孔内 不断地进出于一个个颗粒的微孔内外 这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢 从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱 而达到分离的目的 常用的凝胶 葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力 而使生物分子分离纯化的技术 酶与底物 酶与竞争性抑制剂 酶与辅助因子 抗原与抗体 酶RNA与互补的RNA分子或片段 RNA与互补的DNA分子或片段等之间 都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对 故此 亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用 常用的亲和介质及专一性配体 根据欲分离组分与配基的结合特性 亲和层析可以分为 共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析 疏水层析与反相层析的基本原理 本节目录 4 电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳 根据各种蛋白质解离 电学性质上的差异 利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度不同而进行纯化的一类方法 电泳方法按其使用的支持体的不同 可以分为 纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量 同时受颗粒形状和颗粒大小的影响 此外 还受到电场强度 溶液pH值 离子强度及支持体的特性等外界条件的影响 纸电泳 纸电泳是以纸为支持物的电泳技术 操作过程 1 支持物的选择 一般采用层析滤纸为支持物 2 选择一定的PH和一定强度的缓冲液3 点样 量要适当4 电泳 实验时先将一厚滤纸条在一定的pH缓冲液中浸泡 取出后两端加上电极 在滤纸中央滴少量待测溶液 电泳速度不同的各组分即以不同速度沿纸条运动 经一段时间后 在纸条上形成距起点不同距离的区带 区带数等于样品中的组分数 将纸条干燥并加热 将各蛋白质组分固定在纸条上 再用适当方法 进行分析 薄层电泳 薄层电泳 是将支持体与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行的电泳技术 支持体 淀粉纤维素硅胶琼脂淀粉最为常用 淀粉板薄层电泳广泛应用于蛋白质 核酸和酶的分离 薄膜电泳 薄膜电泳 醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持体的电泳技术 薄膜电泳的分辨力虽然比不上纸电泳和薄层电泳 但此法具有简单 快速 区带清晰 灵敏度高 易于定量和便于保存的特点 广泛应用于各种酶的分离 凝胶电泳 凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术 独特之处 具有电泳和分子筛的双重作用 支持体 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂凝胶应用 主要用于酶分子质量的测定 酶蛋白和酶RNA的顺序测定以及酶的分离检测 等电点聚焦凝胶 利用各组分等电点的不同而进行分离的电泳技术 简称为等电点聚焦或者电聚焦 等电点聚焦凝胶在酶和其他蛋白质的分离中广泛应用 优点 1分辨率高 可将等电点相差0 01 0 02PH单位的蛋白质分开 2随着时间的延长 区带越来越窄 而其他电泳由于扩散作用越来越宽 3样品混合液加在电泳的任何部位 经过电泳 由于电聚焦的作用 各组分都可以聚焦到各自等电点PH的位置 4浓度很低的样品都可以分离 而且重现好5可以很准确地测定酶和其他蛋白质 多肽等两性电解质的等电点 缺点 1电泳过程要求使用无盐溶液 有些酶和蛋白质在无盐溶液的溶解度较低 2电泳后各组分都聚焦到各自的等电点 对某些在等电点时溶解度低或可能变性的组分不适用 聚焦电泳的操作过程 1pH梯度支持介质的制备2电泳3分离组分的检测 5 萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术 萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相 有时也可采用其它流体 按照两相的组成不同 萃取可以分为 有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取 有机溶剂萃取 利用物质在水和有机溶剂的溶解度不同而分离 由于有机溶剂容易引起酶和蛋白质的失活变性 酶在萃取过程中 在低温下进行 减少酶和有机溶剂的接触时间 操作过程1选取合适的有机溶剂 考虑酶的溶解度和有机溶剂对酶稳定性的影响 2将欲分离组分和预冷的有机溶剂结合3将有机相和水相分开4加热或抽真空尽快使组分和有机溶剂分开 双水相萃取 利用物质在互不相容的水相中溶解度不同而分离的方法 双水相一般有互不相容的两高分子水相或者盐溶液和高分子水相组成 如聚乙醇溶液和葡萄糖溶液 双水相系统的形成 aqueoustwo phasesystem ATPS 由于两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用 不相容性 一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子 当达到平衡时 即形成分别富含不同聚合物的两相 除双聚合物系统外 聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相 PEG 聚已二醇 polyethyleneglycol Kpi 磷酸钾DX 葡聚糖 dextran 各种双水相系统 双水相萃取由于两相都是水溶液 可以避免酶的失活变性 双水相系统中水的含量高 分离后的酶浓度低 需经过浓缩等以提高产量 双水相系统中含有高分子聚合物或盐类 在分离后需要进一步进行分离纯化 以除去高分子聚合物和盐类等杂质 双水相分离细胞碎片和酶的流程 双水相法分离酶的过程示意图 1 细胞悬浮液 2 细胞破碎机 3 萃取器 4 PEG 5 无机盐 6 离心机 7 含目标产物的上清液 8 含细胞碎片的下相 超临界萃取 超临界萃取又称超临界流体萃取 使利用物质与杂质在超临界流体的溶解度不同而分离的技术 超临界萃取装置 中药材 分离工程 什么是超临界流体 超临界流体 SCF 是指物质的压力和温度同时超过其临界压力 Pc 和临界温度 Tc 时的流体 即 T Tc P Pc 分离工程 超临界流体不是液体 也不是通常状态下的气体 是一种特定状态的流体 1 处于临界点状态的物质可实现从液态到气态的连续过渡 两相界面消失 汽化热为零 2 超过临界点的物质 T Tc 不论压力有多大 都不会使其液化 压力的变化只引起流体密度的变化 超临界流体的性质 1 密度接近于液体 这使它具有与液体溶剂相当的萃取能力 2 黏度和扩散系数与气体相近似 而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是有利于传质的 具有很高的传质速度 3 该流体随着温度与压力的连续变化 对物质的萃取具有选择性 气体 超临界流体和液体性质的比较 超临界流体是指在31 1 和13 78MPa时的CO2 超临界流体萃取 Supercriticalfluidextraction SFE 超临界流体萃取技术 SFE 是利用超临界流体 SCF 作为萃取剂 从液体或固体中萃取出特定成分 以达到某种分离目的的技术 CO2由于具有合适的临界条件 对健康无害 不燃烧 不腐蚀 价格便宜和易于处理等优点 是最常用的超临界萃取剂 超临界流体萃取流程 萃取阶段 在超临界状态下 超临界流体与原料接触进行萃取获得萃取相 分离阶段 使萃取组分与超临界流体分离 萃取阶段 分离阶段 分离工程 由上表中可见 大部分碳氢化合物其临界压力在5MPa左右 对低碳烃化物 如乙烯 乙烷等 其临界温度近常温 而环状的脂肪烃和芳香烃具有较高的临界温度 水和氨具有较高的临界温度和压力 这是因为极性大和氢键的缘故 二氧化碳具有温和的临界温度和相对较低的临界压力 为最常用的超临界流体 对于临界温度在0 100 范围的流体 适用于提取天然植物有效成分 超临界流体萃取的应用 医药工业 化学工业 食品工业 化妆品香料 中草药提取酶 纤维素精制 金属离子萃取烃类分离共沸物分离高分子化合物分离 植物油脂萃取酒花萃取植物色素提取 天然香料萃取化妆品原料提取精制 根据分离方法不同分为 1等压分离2等温分离3吸附分离 改变压力的超临界萃取流程 等温法T1 T2 P1 P2 1 等温变压流程 改变温度的超临界萃取流程 等压法T1 T2 P1 P2 2 等压变温流程 采用吸附分离的超临界萃取流程 3 等温等压吸附流程 吸附法T1 T2 P1 P2 反胶束萃取 定义 利用反胶束将酶或蛋白质从混合溶液萃取出来的一种分离纯化技术 反胶束又称反胶团 是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种集体 反胶束是透明的 热力学稳定的系统 胶束和反胶束结构示意图 3 5酶的组合分离纯化策略 设计分离纯化工艺的基本要求 本章目录 3 6酶的浓缩 干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂 通常是水 分离的过程 在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节 离心分离 过滤与膜分离 沉淀分离 层析分离等都能起到浓缩作用 用各种吸水剂 如硅胶 聚乙二醇 干燥凝胶等吸去水分 也可以达到浓缩效果 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发 使溶液得以浓缩的过程 由于酶在高温条件下不稳定 容易变性失活 故酶液的浓缩通常采用真空浓缩 即在一定的真空条件下 使酶液在60 以下进行浓缩 在固体酶制剂的生产过程中 为了提高酶的稳定性 便于保存 运输和使用 一般都必须进行干燥 常用的干燥方法有 真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥吸附干燥 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程 酶的结晶是酶分离纯化的一种手段 它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品 而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件 酶在结晶之前 酶液必须经过纯化达到一定的纯度 如果酶液纯度太低 不能进行结晶 通常酶的纯度应当在50 以上 方能进行结晶 总的趋势是酶的纯度越高 越容易进行结晶 要说明的是 不同的酶对结晶时的纯度要求不同 有些酶在纯度达到50 时就可能结晶 而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶 所以酶的结晶并非达到绝对纯化 只是达到相当的纯度而已 盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶等电点结晶 本章目录 结晶 三步曲 第一步 形成过饱和溶液 稍微越过饱和状态 处于介稳态 浓缩 降温 少有升温 调节pH至pI 可使溶液趋于过饱和 第二步 形成晶核 过饱和溶液在一定条件下可形成极微小的有序排列的固相物 成为后续晶体生长的核心 称为晶核 振荡 搅拌 快速降温可促使过饱和溶液形成晶核 有时可投入少量 晶种 微粒 第三