实验13DNA片段的PCR扩增.docx

实验13 DNA片段的PCR扩增实验目的：1.简述PCR技术的原理，说出PCR扩增过程。尝试用PCR仪扩增目的基因的实验操作。 2.尝试用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测的基本操作。实验原理：1.PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起始点，沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。2.琼脂糖凝胶电泳原理：在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速率，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据DNA分子的大小使其分离。 4S Red Plus核酸染色剂是一种独特的油性大分子物质，其分子量约为1000左右，能与DNA静电结合。 4S Red Plus 在紫外光下可获得最佳激发，可用和观察EB染色相同的普通紫外凝胶透射仪观察。实验材料：极速PCR试剂盒（TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、引物I、引物II、模板DNA），微量移液器，微量离心管，PCR仪，凝胶电泳槽，50ml三角瓶，微波炉，振荡器, 4S Red荧光染料, 6上样缓冲液(Loading Buffer) TAE电泳缓冲液。实验过程：一、PCR扩增实验1. 打开PCR试剂盒，依照说明书清点各种试剂；待离心管中溶液溶解后将所有离心管5000rpm离心30s，使管壁没有残留药品。使用TaqDNA聚合酶时应保证其在低温条件下（如置于冰盒中）2. 上课前1小时，向装有TaqDNA聚合酶的离心管中加入以下成分290L ddH2O、50L10buffer和50L MgCl2，轻弹离心管管壁混匀试剂，瞬时离心一次，将壁上试剂全部甩入管底。3. 每组取80L已配好的预混液（在标有TaqDNA聚合酶的离心管中）加入到1个0.5ml离心管内，然后按下表依次加入相关液体得到反应液。反应试剂用量dNTPmixture4L引物I5L引物II5L模板DNA5L4. 每组取20L已配好的反应液（0.5ml的离心管中）加入到1个0.2ml离心管内，加入15L石蜡封闭体系。（1.2组的同学进行12次循环；3.4.5组的同学进行30次循环）5. 将离心管放入全自动基因扩增仪中，按下面程序设定参数，进行PCR扩增实验循环过程温度时间循环次数预变性9530s变性9520s0次或12次或30次退火5220s延伸7220s保温7230s总计0s或780s或1860s二琼脂糖凝胶电泳（兴趣小组完成）1. 溶胶用天平称取琼脂糖0.5g，加入到盛有50ml电泳缓冲液的三角瓶中。将三角瓶用封口膜盖上，微波炉中溶化呈透明状。2.制胶将溶化的的琼脂糖冷却到60，加入适量的5L Red 4S荧光染料后，倒入有托盘和梳子的制胶槽中。放置20-30min完全冷却至凝固，小心垂直拔出梳子。使加样孔端置阴极段放进电泳槽内，轻压使凝胶固定在电泳槽底部。3.加样用微量移液器取2L 6上样缓冲液(Loading Buffer)置于0.2ml离心管上，并向其中加入本组扩增的10L PCR产物，反复吹吸混合均匀，制备成样品混合液,然后加入加样孔中。用微量移液器向加样孔中直接加入10L Marker，用以对照。4.电泳盖上电泳槽盖，黑色对准黑色，红色对准红色；将直流电泳仪的电压设为为120V，样品应该从负极向正极泳动，开始电泳。当溴酚兰的带（蓝色）其移动至距胶板前沿约1cm处，关闭电源（约15-20min）。5.观察取出凝胶放入在DNA图谱观察仪中,打开紫外灯，观察核酸条带，分析实验结果。实验结果：1.绘制PCR扩增目的基因模式图2.绘制电泳之后的图谱实验分析与讨论： 体内DNA复制和体外DNA复制分别需要哪些条件？ 程序设计