HPLC中常用的检测器.ppt

1 一 目前HPLC中常用的检测器 检测器是一套分离分析设备的关键 目前有两种基本类型的检测器 一类是溶质性检测器 它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应 属于这类检测器的有紫外 荧光 电化学检测器等 另一类是总体检测器 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应 属于这类检测器的有示差折光 蒸发光散射 电导检测器等 2 1 紫外 可见光 UV VIS 检测器 工作原理 基于Lambert Beer定律 即被测组分对紫外光或可见光具有吸收 且吸收强度与组分浓度成正比A lgIo I bc其中A为吸光度 消光值 Io为入射光强 I为透射光强 为样品的吸光度 消光系数 b为光程长 c为样品浓度 通用型检测器约有80 的分析样品具有紫外吸收 可以使用这种检测器检测 3 优点 a 灵敏度高 检测下限约为10 6g mlb 线性范围广C 对温度和流速不敏感 适于进行梯度洗脱 4 限制 a 没有紫外吸收的物质不能检测b 应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相 限制了一些一些截止波长在200 300nm之间的良好溶剂的使用 5 2 荧光检测器 原理 物质的分子或原子经光照射后 有些电子被激发至较高的能级 这些电子从高能级跃至低能级时 物质会发出比入射光波长较长的光 这种光称为荧光 荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱 在样品浓度足够低时 下 荧光强度与如射光强度 量子效率及样品浓度成线形关系 荧光强度 F I0 LC荧光检测器是一种选择性检测器不到20 的物质使用这种检测手段 许多药物如喹诺酮类药物采用这种检测方法 6 在垂直的方向上进行检测 7 优点 a 灵敏度非常高 灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高 其检出限可达10 9g ml 比紫外检测器高2 3个数量级 适合于痕量分析 b 可以用于梯度洗脱c 对仪器的稳定性 如温度和压力的稳定性 依赖较小d 选择性好 优于紫外例子 花生酱提取物中衡量黄曲霉素的荧光检测法 8 缺点 a 适用范围有一定的局限性 只适用于有荧光基团 衍生化之后有荧光基团的化合物b 定量分析时线性范围较窄它适合于稠环芳烃 氨基酸 胺类 维生素 蛋白质等荧光物质的测定 9 3 二极管阵列检测器 diode arraydetector DAD 原理 光电二极管阵列 或CCD阵列 硅靶摄像管等 作为检测元件的UV VIS检测器 它可构成多通道并行工作 同时检测由光栅分光 再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号 然后 对二极管阵列快速扫描采集数据 得到的是时间 光强度和波长的三维谱图 年 ilano等人首先报道这种检测器 它不必停留就可获得 在流 色谱的全部光谱信息 可跟随色谱峰扫描 用来观察色谱柱流出组分的每个瞬间的动态光谱吸收图 由于比其他快速扫描检测器具有结构简单 工作可靠 性能好的优点 自一问世 就得到迅速发展 10 结构 核心是二极管阵列元件 它由一系列光敏二极管蚀刻在硅片上组成 一般 每个阵列又 个光电二极管组成 他们的光敏范围是 nm 每只二极管的分辨率是 nm 光电二极管越多 分辨率越高 阵列的每一单元有一只光敏二极管和一只与之并联的电容器 光电二极管紫外检测器n个单元同时检测 从而使采样时间减少到普通的 使用 个二极管的阵列元件 最快时 每 ms可完成一次测量 每秒中可以收集 个数据 11 12 与普通UV VIS检测器不同之处 a 普通UV VIS检测器是先用单色器分光 只让特定波长的光进入流动池 而二极管阵列UV VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池 然后通过一系列分光技术 使所有波长的光在接受器上被检测 b 普通UV VIS检测器只能得到二维的谱图 而DAD可以得到三维图谱 13 14 应用 a 色谱峰纯度检查比较光谱法吸收比法双波长法b 色谱峰鉴定与标准品或标准光谱比较正常紫外光谱的比较三维色谱能提供更多全面的信息 15 4 电化学检测器 理论基础a 法拉第第一定律在电介过程中 电极上起反应的物质量 W 与通过电介池的电量 Q 成正比 b 法拉第第二定律各种不同的电介质溶液中 通过相同的电量时 电极上析出的电极产物的当量数相同 96487库仑 16 优点 a 专用型检测器 具很强的专属性 b 线性范围可达106 宽广c 高灵敏度10 12g l 可与荧光相比 17 缺点 a 只能测定具有电解活性 电氧化一还原性 物质b 要求洗脱液具有导电性 可向洗脱液中加入少量电解质 或在柱后补加适量电解质溶液 这并不影响分离效率 现在在药物分析领域里面已经没有其他方法常用了 18 5 示差折光检测器 RID 原理 化合物的折光率不同 光会偏转 光偏转的程度与样品的浓度成正比 根据不同浓度的物质具有不同折射率来进行组分检测的 溶液的折射率是溶剂 流动相 和溶质 样品 各自的折射率乘以各自的摩尔浓度之和 溶有样品的流动相与流动相本身之间折射率之差就表示样品在流动相中的浓度 原则上 凡是与流动相折射指数有差别的样品都可以测定它的浓度 通用型检测器 浓度检测器 检测限可达 g ml 19 优点 通用性强 操作简便 20 缺点 a 灵敏度低b 过于娇贵 室温的变化会影响基线的稳定性 大的溶剂前沿峰可能会掩盖前期脱洗的色谱峰 21 注意事项 a 洗脱液的组成一定要恒定 不能使用梯度洗脱 b 不能使检测池带压工作 在与其它检测器串联使用时应放在最后 c 流速要恒定 泵的流速波动要小于0 5 使用往复泵时要用阻尼装置 d 温度要恒定 恒温控制要达 10 4 在使用时预热时间要充足 否则基线漂移十分严重 22 6 蒸发光散射检测器 ELSD 原理 色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴 与通入的气体 通常是氮气 有时也用空气 混合均匀 经过加热的漂移管 蒸发除去流动相 样品组分形成气溶胶 用强光或激光照射气溶胶 产生光散射 用光电二极管检测散射光 散射光的强度 I 与组分的质量 m 有下述关系 I km或lgI blgm lgk其中k和b为与蒸发室 漂移管 温度 雾化气体压力及流动相性质等实验条件有关的常数 23 ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物 如 碳水化合物 脂类 聚合物 未衍生脂肪酸和氨基酸 表面活性剂 药物 并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物 响应不依赖与样品的光学特性 任何挥发性低于流动相的样品均能被检测 不受其官能团的影响 ELSD的响应值与样品的质量成正比 因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物 24 发展历程 第一台ELSD是由澳大利亚的UnionCarbide研究实验室的科学家研制开发的 并在八十年代初转化为商品 八十年代以激光为光源的第二代ELSD面世 现在ELSD越来越多的作为通用型检测器用于高效液相色谱 超临界色谱 SFC 和逆流色谱中 目前主要有4种商品化的ELSD 即 Sedex Eurosep PL ELS和Alltech 25 PL ELS2100 组分进入检测器的入口 26 结构 商品化的ELSD都是三部分组成 即雾化器 加热漂移管和光散射池 a 雾化器与分析柱出口直接相连 柱洗脱液进入雾化器针管 在针的末端 脱洗液和充入的气体 通常为氮气 混合形成均匀的微小液滴 可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生的液滴的大小 b 漂移管的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发 流动相中的不挥发成分经过漂移管进入光散射池 c 在光散射池中 样品颗粒散射光源发出的光经检测器检测产生光电信号 ELSD采用的光源一般为卤素灯 27 28 ELSD检测只要分为三个步骤 1 用惰性气体 一般是用N2 雾化脱洗液 2 流动相在加热管 漂移管 中蒸发 3 样品颗粒散射光后得到检测 29 重要参数与影响 的因素 a 雾化室温度 影响不大b 氮气流速 气体流速增大 使响应值减小 故最佳气体流速是在可以接受的噪声基础上所产生的最大检测响应值的最低气体流速 c 漂移管温度 温度过低则流动相得不到充分挥发 使基线水平较高 温度过高则可能带来更大的噪声 最佳温度是在流动相基本挥发的基础上产生可接受噪音的最低温度 d 流动相流速 盐对基线噪音的影响 对于高浓度的盐 盐的不完全挥发会造成基线增高 使样品响应值受气体流速的影响相对变小 对于低浓度的盐 盐的完全挥发使响应值受其影响较大 所以 对用做缓冲液的盐 既要容易挥发 又要具有好的纯度 一般盐的挥发性越大 所需的气体流速和漂移管温度越低 30 特点 因为ELSD在检测前将流动相蒸发 所以基线的噪声和漂移都很小 因此基线稳定和样品检测的灵敏度高 流动相的蒸发使得ELSD和梯度脱洗相容 因而可提高色谱分离的分辨率和缩短分离时间 不像紫外检测器 ELSD的激光源无需更换 大大降低了运行成本 要求更低的气体压力和气体流速 1L min 可以使用气瓶 空压机或气体发生器 31 ELSD与UV D比较 a UV检测的主要缺点在于紫外不吸收的化合物灵敏度很低 ELSD可以检测任何挥发性低于流动相的样品 b ELSD的通用性响应值使得ELSD响应值比UV响应值更能代表样品的质量c 不同于紫外检测只能使用不吸收紫外的流动相 ELSD能与任何的挥发性流动相相容 不论其光学特性 用紫外检测器定量未知物是困难的 因为样品的紫外吸收值往往和代表样品的质量的色谱峰的大小无关 ELSD对几乎所有的样品给出一致的响应因子 因此可以通过和内标比较定量未知化合物 在因缺乏标准品而无法校正曲线的情况下 利用ELSD可以近似的提供不纯物的定量测定 32 ELSD可以检测出UV图谱检测不出的峰 33 ELSD与示差折光检测器比较 ELSD优点 a 灵敏度大大提高 S N高5 10倍 检测限可达ng级b 能进行梯度脱洗 是多成分分析中强有力的检测手段c 对环境温度变化不敏感 d 基线稳定 不会产生漂移缺点 a RID上使用的流动相不受特殊的制约 但是 ELSD由于以流动相挥发为大前提 限定为挥发性物质 不能使用磷酸缓冲液等 b RID可在宽广的范围内取得直线性 而ELSD由于原理上物质量与散射强度成为指数关系 必需采用双对计算使工作曲线线性化 34 ELSD的基线更加平稳 35 ELSD与HPLC MS的关系 ELSD与HPLC MS的色谱要求一致 二者可通用 在脱机的情况下 使用HPLC ELSD不仅可以为LC MS摸索色谱条件下 节省昂贵的LC MS系统的操作成本 而且可以方便的用LC MS来分析检测出的不纯物 进行结构鉴定 36 同一个样品分别用ELSD LC MS得出的洗脱曲线 37 7 各种检测器比较 38 二 ELSD的应用 1 大多数的脂类分子都缺乏适当的发色团 因此脂类除非通过衍生化 否则不能用紫外检测 一般一个品种含有的各种脂类其极性差异很大 要各个组分的最佳分离和分辨率需要使用梯度脱洗 因而限制了示差检测器的使用 不同于UV和RI的局限性 ELSD是脂类检测的有用工具 2 碳水化合物不带有发色团 因而不能用UV来检测 他们通常用氨基柱或者阳离子交换树脂分离 但是示差检测器不是很灵敏 而且需要控制温度来维持基线稳定 不能与梯度脱洗相容 ELSD灵敏度高 基线稳定 与梯度脱洗相容 如中药多糖类和苷类 人参 黄芪 三七中的有效成分 的分析 质量控制中 ELSD是首选的手段 39 例子 高效凝胶色谱法测定芪参多糖分子量及其分布 色谱柱 Polysep GFC P4000 300 7 80mm Phenomenex 流动相 纯化水流速 0 50mL minELSD检测器漂移管温度 60 ELSD检测器雾化室温度 40 ELSD检测器气泵流速 1 60l minELSD检测器压力 260psiELSD检测器gain值 1 0色谱工作站 英谱HS色谱数据工作站 带GPC软件 40 1 取系列标准分子量多糖 制成5mg mL水溶液