药物分析—抗生素类药物

第十四章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,抗生素:在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称 . 来源：,化学合成,半合成,生物合成（发酵）,一、抗生素类药物的特点1.化学纯度低同系物、异构体、降解物；2.活性组分易发生变异菌株、发酵条件；3.稳定性差活泼基团。,二、抗生素药物的质量分析 抗生素药物的质量控制方法与一般化学药品一样，通过鉴别、检查、含量（效价）测定三个主要方面来判断其质量的优劣。 采用生物学法与物理化学法.,一）鉴别试验： 1官能团的显色反应 2光谱法 3色谱法 4生物学法（抑菌能力），已少用。,青霉素钠 鉴别 取本品与已知含量的青霉素适量，分别加水制成每1ml中约含50g的溶液，各取1ml ，加入不少于200 单位的青霉素酶溶液1ml,在37灭活1小时后，取灭菌滤纸片，分别用上述溶液浸湿后，用滤纸吸去多余的液体，置摊布金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的培养基上，在37培养约16小时后均无抑菌作用，而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。,（二）杂质检查 1影响产品稳定性的指标（酸碱度、水分） 2控制有机和无机杂质的指标（澄清度、残留溶剂） 3与临床安全性密切相关的指标（异常毒性、热 原、细菌内毒素、降压物质等） 4其他指标（如内酰胺类“聚合物”的检查）,（三）含量测定或效价测定 1微生物检定法 以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价（potency）的一种方法。 其测定方法有管碟法、浊度法。 对分子结构复杂、多组分的抗生素，仍为首选方法。,优点,1、与临床应用一致2、灵敏度高3、适应范围广,缺点,1、操作繁琐2、培养时间长3、测定误差大,2理化方法 根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。,优点,1、准确度高2、简单、快速,对所选理化方法的要求： 正确、专属、省时、用样少、试剂易得、操作简单、结果与生物效价吻合，如HPLC 法。,3、抗生素活性表示方法 抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用单位（u）表示或微克（g）表示。如1mg青霉素钠为1670单位， 1mg青霉素钾为： 1M青霉素钠/M青霉素钾1670=1598单位,三、抗生素分类 内酰胺类 氨基糖苷类 四环素类 氯霉素类 大环内酯类 其他类,第二节 -内酰胺类抗生素,包括青霉素族和头孢菌素族化学结构 ：,青霉素类,头孢菌素类,6-APA,7-ACA,1,4,3,2,4,3,5,1,2,6,青霉素（青霉素G、苄青霉素）,氨苄西林（氨苄青霉素）,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢羟氨苄,头孢氨苄,一、结构特点：,1)青霉素和头孢菌素分子中都有一个游离羧基和酰胺侧链。2)氢化噻唑环或氢化噻嗪环与-内酰胺并合的杂环，分别构成二者的母体：6-APA、 7-ACA。3)青霉素分子中含有三个手性碳原子(C3、C5、C6)，头孢菌素分子中含有两个手性碳原子(C6、C7)。,性质1 ：酸性与溶解度,分子中游离羧基具有相当强的酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。,性质2 ：旋光性,青霉素族分子中含有三个手性碳原子，头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都具有旋光性。根据此性质，可用于定性和定量分析。,性质3 ：紫外吸收特性,1、青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,性质4 ： -内酰胺环不稳定性,干燥条件下青霉素盐稳定。青霉素水溶液在pH6-6.8时较稳定。 -内酰胺环是该类抗生素结构最不稳定的部分。,四元环张力大,酰胺键易水解,不稳定性因素,、羟胺,例,青霉素的降解反应,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,例,1羟肟酸铁反应 青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。,二、鉴别试验：(一)呈色反应,+,例：ChP(2005)头孢哌酮,鉴别 取本品10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液取34.8%盐酸羟胺溶液1份，醋酸钠-氢氧化钠溶液1份，乙醇4份3ml，振摇溶解后，放置5min，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。,2类似肽键的反应,（1）某些具有-氨基的本类药物，如氨苄西林，遇茚三酮即显蓝紫色。,-氨基、伯胺某些羟基胺类,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,缩合,蓝紫色,（2）双缩脲反应,-内酰胺类,似肽键,（开环分解）,紫红色,-内酰胺类,碱性 铜溶液,b,（1）与重氮苯磺酸呈色反应,（偶合）,3其他显色反应,（偶合）,头孢哌酮,（2）硫酸-硝酸呈色反应,头孢菌素能与硫酸-硝酸反应后呈色。此显色反应可区别某些头孢菌素族抗生素，因此被一些国家药典采用供鉴别。 如中国药典(1995年版)收载的头孢噻吩钠呈红棕色；头孢氨苄呈黄色；头孢噻肟钠呈亮黄色。,（3）变色酸-硫酸呈色反应,中国药典(1995年版)采用本法鉴别。如阿莫西林林加变色酸-硫酸试剂混合后，于150加热2-3min，因分解出甲醛与变色酸缩合而呈深褐色。,（二） 沉淀反应,例 青霉素钠 青霉素钾 Ch.P（2000） 【鉴别】（2）取本品约0.1g，加水5ml溶解后，加稀盐酸2滴，即生成白色沉淀；此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或过量的盐酸中溶解.,2. 重氮化-偶合反应,芳香第一胺类反应,普鲁卡因青霉素,例 普鲁卡因青霉素 Ch.P（2000） 【鉴别】（3）本品显芳香第一胺类的鉴别反应（附录）。,（三）钾、钠离子的焰色反应,例 青霉素钠 Ch.P（2005） 【鉴别】（4）本品显钠盐的火焰反应（附录 ）。,例 青霉素钾 Ch.P（2005） 【鉴别】（3）本品显钾盐的火焰反应（附录 ）。,头孢氨苄 max = 262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50,2、紫外分光光度法(UV),（四）光谱法,1、红外吸收光谱法,（五）色谱法,1、TLC法,对照品对照法,2、HPLC法,三、特殊杂质的检查,本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。,四、含量测定（一）电位配位滴定法汞量法,*内酰胺类不直接与汞盐反应*内酰胺类水解产物可与汞盐 发生定量反应,1. 原理,Ch.P（2000）青霉素钾青霉素钠苯唑西林钠普鲁卡因青霉素氯唑西林钠,青霉胺与硝酸汞发生络合反应。先按2分子青霉胺与1分子汞离子的比例络合，发生第一次滴定突跃，但突跃范围很小，变化比较平缓，不宜用于做终点，继续用硝酸汞滴定时，青霉胺分子与汞离子按1:1的比例络合，生成稳定的络合物青霉胺络汞，发生第二次滴定突跃。其突跃范围较大，变化较急剧，宜于确定终点。,2. 方法,醋酸盐缓冲液,滴定,水解,pH4.6,3. 讨论,（1）电位法指示终点，以第二次滴定 突跃为终点 反应摩尔比1:1,（2）空白试验 用未降解样品测定,（3）优点 不需标准品,例 青霉素钠 Ch.P（2000） 【含量测定】取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀,放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液（pH4.6）20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法（附录 A）, 用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）缓慢滴定，（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。,每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的总青霉素（按C16H17N2NaO4S计算）。 另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下,立即用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）滴定，滴定终点判断方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。每1mg的C16H17N2NaO4S相当于1670青霉素单位。,（二）RP-HPLC法,特点 快速 高效 灵敏度高 专属性强 重现性好 一法多用(鉴别、检查、含测),Ch.P,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素,链霉素,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,多与硫酸成盐,链霉素 3个,庆大霉素 5个,碱性中心,（一）碱性,（三）苷的水解与稳定性,链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212,链霉素在230nm处有吸收，庆大霉素、奈替米星无吸收,羟基胺结构,硫酸庆大霉素鉴别 取本品约5mg ，加水1ml 溶解后，加0.1 茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml 与吡啶 0.5ml，在水浴中加热5 分钟，即显紫蓝色。,链霉胍特有反应,（或-萘酚）,8-羟基喹啉, -萘酚,链霉糖特征反应,紫红,麦芽酚,吡咯衍生物,红色,（Elson-Morgan反应）,H+,H+,光谱法,（七）,庆大霉素无UV吸收,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法 TLC中的对照品法 （BP）,1. 来源 反应中间体,链霉素、庆大霉素,微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,离子交换色谱法离子对色谱法RP-HPLC法,HPLC法,第四节 四环素类抗生素,四环素（TC）tetracycline,金霉素 (CTC) chlortetracycline,土霉素 (OTC) oxytetracycline,氧四环素,多西环素 (DOTC) doxycycline,脱氧土霉素,酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性,二甲胺基 弱碱性,1.与酸、碱均能成盐，临床多用盐酸盐2.强酸或强碱中溶解度,多含结晶水,旋光性、UV、荧光,（三）,pH3 7.5 荧光,（1）,差向异构化,淡黄黑,蓝色荧光,（土霉素、多西环素不易发生差向异构化）,（1）酸性下降解,max = 445nm,max = 435nm,橙黄色,脱水四环素,TC,ETC,ATC,EATC,（3）碱性下降解,（荧光）,（三）荧光法,HPLC法,（五）,EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象,（六） IR 法,硅藻土做载体,HPLC法,自身稀释对照法,盐酸四环素,杂质吸收度,HPL