《克隆基因治疗》PPT课件.ppt

细胞分化的可逆性 个体发育 细胞分裂分化的过程 一个受精卵是有全能性的 它可以产生各种类型的细胞 在个体发育的什么阶段 细胞的全能性受到了限制呢 一直认为植物细胞具有全能性 动物细胞不具有全能性 直到1997年2月 苏格兰学者用体细胞核移植技术培养成 多莉 绵羊 这一动物细胞无全能性的观点才发生动摇 其实 壁虎再生失去的尾巴 涡虫 蚯蚓可以再生失去的部分都说明动物细胞是具有全能性的 只不过是能够再生的组织和器官在数目和种类上是有限的 特别是高等动物 一 植物的组织培养 植物的组织培养 在体外人工培养植物组织和细胞的技术 例 胡萝卜韧皮部的单个细胞重新发育成一个完整的个体 现在小麦 玉米 水稻等很多植物都可以通过组织培养获得愈伤组织 产生新的个体 因此 分化的细胞 可以从高度的分化状态回复过来 脱分化 重新再分化 形成植株 即植物细胞具有全能性 二 动物的核移植试验 一 移植开端1938年汉斯 施佩曼提出他称之为 奇异的实验 的设想 从发育到后期的胚胎 成熟的或未成熟的胚胎均可 中取出细胞核 将其移植到一个卵子中 1952年 研究细胞全能性的第一个人R Briggs 罗伯特 布里格斯 豹纹蛙 囊胚期细胞核 去核的同种蛙卵 卵发育成个体 即克隆 胚胎后期到蝌蚪 成蛙的细胞 细胞核去核的同种蛙卵 失败 认为胚胎早期细胞核具有全能性 而胚胎以后各个时期的细胞核难以体现全能性 即分化难以逆转 多数生物学家转向以未成熟的胚胎细胞克隆动物的领域 二 动物的核移植试验 二 胚胎细胞核移植 胚胎细胞克隆胚胎早期 囊胚期 的细胞核移入去核的异种动物的受精卵中 使受精卵发育成个体的过程 鲤鱼囊胚细胞鲫鱼受精卵 具有生殖能力取核去核受精卵肌肉蛋白含量比鲤鱼高 3 78 融合 培育 杂交鱼 脂肪含量比鲤鱼高5 58 1除核 2注核 3注核 4注核 5注核 6电击 三 体细胞核移植 体细胞克隆 动物体细胞克隆技术又称体细胞核移植技术或无性繁殖技术 它是用动物特定发育阶段的核供体 体细胞核 及相应的核受体 去核的原核胚或成熟的卵母细胞 卵细胞 不经过有性繁殖过程 进行体外重构 并通过重构胚的胚胎移植 从而达到扩繁同基因型动物种群的目的 1 体细胞克隆的类型 1 同种体细胞核移植 科学家用取自一只6岁成羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊 2 异种体细胞核移植 陈大元等将大熊猫的子宫上皮细胞 骨骼肌细胞和乳腺上皮细胞的细胞核移入去核的兔卵母细胞后 分别有9 9 6 8 和11 7 的重构卵发育到囊胚 染色体 线粒体DNA和核DNA分析均证实异种重构胚的核遗传物质来自大熊猫供体细胞 这不仅开创了大熊猫体细胞移核的先例 而且也是首次大熊猫体细胞核的异种移核 对大熊猫的快繁及保护提供了一线希望 三 体细胞核移植 体细胞克隆 2 体细胞克隆的一般方法胎儿细胞或成年动物已分化的细胞作为核供体 进行细胞核移植 得到与供体细胞具有同性质动物的过程 克隆羊 多莉 的克隆方法如下 A羊乳腺细胞B羊未受精卵 取出细胞核除去细胞核的卵 融合 显微注射 电击融合早期胚胎发育 胚胎移植到C羊子宫 C羊分娩产下 多莉 与A羊同 山东皮肤细胞克隆牛 北京克隆牛欣欣 欣欣之母 莱阳农学院克隆牛 四 关于克隆人 1997年 克隆 即无性繁殖 羊 多莉 的问世 让人们听到了克隆人的脚步声 由于克隆人不单纯是科技问题 更是对人类社会及其未来命运有着非同寻常影响 所以国外各界人士纷纷从科学 哲学 包括科技哲学 价值哲学 伦理学 宗教哲学 社会学 法学 心理学等不同角度 对克隆人问题展开了广泛的探讨 克隆人 三疯子 的科学家是 美国 克隆基金 主任布瓦瑟利耶 肯塔基州列克星顿大学激素学院院长扎沃斯和意大利科学家安蒂诺里 由于此三人是克隆人的坚定推崇者 因此被学术界称为 科学疯子 四 关于克隆人 1 克隆人就在我们身边 1 体细胞克隆人的过程 人造人 2 同卵双胞胎的产生过程 天然的克隆人同卵双胞胎 由同一个受精卵一分二 而二个细胞各自发育形成二个独立个体 二个人不但细胞核 细胞质完全相同 而在完全相同的子宫环境发育成长 比由克隆技术产生的克隆人有更完美的吻合度 这个完美的天然的克隆人是一种更为完美的克隆人 真正意义上的克隆人 同卵双胞胎 四 关于克隆人 天然的克隆人 四 关于克隆人 2 治疗性克隆与生殖性克隆治疗性克隆 体细胞核 卵细胞 新的细胞 桑椹 胚胎干细胞 克隆人体器官 供医学研究 解决器官移植供体不足问题等 例如 治疗性克隆希望使用病人自己细胞中的遗传物质来产生胰岛以治疗糖尿病 或者产生神经细胞来修复受损的脊髓 2 治疗性克隆与生殖性克隆 生殖性克隆 即通常所说的克隆人 体细胞核 卵细胞 新的细胞 桑椹 胚胎干细胞 胚胎植入到一个女性子宫 婴儿如果干细胞保留时间超过14天 它就可能长出神经元 此时 这一细胞就有了生命意义 据报道 1999 11 1998 11 美国科学家在马萨诸塞州的细胞技术公司 用人的皮肤细胞克隆出首个人类胚胎 12天后把它焚化烧毁 目前国际上已对治疗性克隆规定了三条原则 一是取得的材料卵子 体细胞 必须是自愿的 不能是骗来的 不能是买来的 提供者有知情权 二是胚胎细胞保留时间不能超过14天 超过了 就被视为动机不纯 有克隆人之嫌 三是不能将克隆的胚胎细胞植入人体子宫 辽宁省计划生育研究院王彤博士等人在我国首次完成人类全胚胎体外培养取得成功 目前止共培养成活28例人类胚胎 存活最常至今22天 左图是培养液中的约1cm长的人胚胎 受精后20 50天胚胎长度2mm 1cm 2004年4月19日钱江晚报 五 体细胞克隆目前存在的问题 体细胞克隆已在牛 绵羊 山羊 小鼠和猪等动物中取得了成功 但在其它动物上还有待进一步验证 其总体水平仍处于实验研究阶段 走向实践运用还面临许多问题 主要表现在以下几个方面 1 费用高 效率低 通过体细胞克隆动物的费用非常高 如仅用于制作 多莉 的费用就超过了200万英镑 同时效率很低 根据目前的研究报道情况综合来看 克隆绵羊只有3 左右的重组胚能发育为正常后代 在克隆牛的研究中 重组胚的囊胚发育率最高能达49 约有80 的移植胚能发育为正常胎儿 但胎儿出生后的死亡率达50 克隆小鼠研究中 只有2 3 的重组胚能发育产仔 仔鼠死亡率也高达40 以上结果说明 体细胞克隆技术仅处于初步研究阶段 还需要在其它动物上进一步充分研究 以提高生产效率 四 体细胞克隆目前存在的问题 2 克隆胎儿初生体重增加 质量差 由于培养基中血清的存在 导致早期胚胎基因表达发生改变 致使许多克隆动物初生重增加 很难自然分娩 大多数需人工辅助 初生儿还伴有各种缺陷 死亡率增高 出现这一现象的原因还不清楚 目前只能从优化培养条件及操作程序入手以减少胎儿死亡率 3 克隆动物生长发育不正常 非正常死亡率高 研究发现 有些用修饰过的细胞培育出的克隆动物存在缺陷 它们在生长过程中会出现难以预料的后果 多莉 羊在生长过程中就出现了比同龄羊提前衰老的现象 而且现已死亡 亦有研究表明 克隆鼠成年后常患有肥胖症的原因与早期胚胎阶段的细胞缺陷有关 五 成功率低的原因 尽管也有少数成功率较高的报道 但目前公认的体细胞克隆成功率在1 3 克隆胚胎移植后的出生率平均不到10 胎儿异常 流产和围产期死亡率高 出生后一周的死亡率最高可达100 原因七方面 1 不能高效率的去除受体卵母细胞的染色体 现有的各种去核技术都要损失部分卵母的细胞质 2 重组胚的融合和卵母细胞质的激活3 供体核与受体胞质细胞周期同步的问题 供体核与受体胞质细胞周期同步与否是影响克隆胚胎发育的重要因素之一 目前通用的受体胞质是M期的卵母细胞 目前一般认为 除了S期以外 其它各时期细胞均可作为核供体 五 成功率低的原因 4 线粒体来源问题 无论直接注射还是细胞融合 供体核都带入一部分细胞质 于是 就出现了移核胚胎的线粒体来源问题 结论不一致 来源于受体 来源于共体与受体双方 5 端粒的问题 端粒 telomere 是染色体端部特化部分 因无黏性而能防止染色体黏着 细胞每复制一次端粒核苷酸就减少50 100bp 端粒复制要靠端粒酶 telomerase 正常细胞缺乏此酶 故端粒随细胞分裂而变短 细胞衰老 而生殖细胞和癌细胞则都有此酶 因此不衰老 那么 克隆动物是否会遗传供核细胞缩短的端粒而提前衰老呢 不一致 多莉短 克隆牛不短 五 成功率低的原因 6 X 染色体灭活问题 雌雄哺乳动物的基因剂量补偿是通过灭活雌性动物的一条X 染色体来实现的 正常情况下 着床前胚胎的两条X染色体都活动 后来 上胚层中X染色体随机灭活 而滋养层细胞则专门灭活父系X染色体 死亡克隆胎盘X染色体随机灭活 但活克隆为父亲X染色体灭活 7 克隆胚胎某些基因的再程序化异常 已经证明 受精后父系和母系基因组都发生广泛的去甲基化 有人证明 牛着床前移核胚胎中有些重复序列的甲基化异常 某些胚胎基因往往不能再激活 这说明 大多数克隆胚胎的后成性再程序化异常 不彻底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因 医用细胞工程 基因导入基因治疗GeneTherapy 内容提示 基因治疗 genetherapy 体细胞基因治疗 生殖细胞基因治疗基因转移方法靶细胞特点 靶细胞种类反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应 基因治疗 Genetherapy 基因治疗 Genetherapy 指应用DNA重组技术 将外源正常基因导入靶细胞 以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病 以达到治疗的目的 为达到这一目的 实施相应的策略 一 基因治疗策略策略 直接基因治疗和间接基因治疗1 直接基因治疗 纠正突变基因在原位修复缺陷的基因 以达到治疗目的 为较理想的基因治疗策略 由于存在某些问题 目前正在努力之中 未实现 2 间接疗法 以正常的基因替代致病基因 导入外源正常基因 代替有缺陷的基因 而对靶细胞而言 没有去除或修复有缺陷的基因 用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因 使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的 途径 就基因转移的受体细胞不同 基因治疗有两种途径 1 生殖细胞基因治疗2 体细胞基因治疗 1 生殖细胞基因治疗 将正常基因转移到患者生殖细胞 精细胞 卵细胞 早期胚胎 使其发育成正常个体 为理想的治疗方法 从根本上治疗遗传病 使其有害基因不能在人群中散播 但还存在某些问题 1 靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展 2 基因转移效率不高 只能用显微注射方法 3 只适用于排卵周期短而次数多的动物 很难适用于人类 但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法 一次可获取少者3 5个 多者十几个 2 体细胞基因治疗somaticcellgenetherapy 将正常基因转移到体细胞 使之表达基因产物 以达到治疗的目的 但有害基因能遗传给后代 措施 1 正常基因转移至体外培养的体细胞 有效表达后 再回输到体内 2 正常基因导入靶细胞 定位整合到染色体上 准确的替换异常基因 是理想的措施 3 随机整合 非特定座位 只要有效的表达即可达到治疗的目的 4 体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞 存在的问题 对特定座位基因转移 目前还存在较大困难 随机插入可能引起后代的基因突变 二 基因治疗的方法 基因治疗的关键性步骤 目的基因的获得与转移 基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离基因克隆 定位 表达 评价表达情况 一 目的基因的获得 正常基因的分离与克隆 二 外源基因的转移 通过不同方法 将目的基因转移至受体细胞 1 物理方法 1 电穿孔法 electroporotion 将细胞置于高压脉冲电场中 通过电压使细胞产生可逆性的穿孔 周围基质中的DNA可渗进细胞 进而表达 瞬间细胞细胞膜核膜通透性增加高压脉冲DNA渗入细胞 2 显微注射法 microinjection 利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核 例 转基因动物的制备 重组基因DNA微注射 体外 小鼠受精卵回植假妊娠仔鼠动物模型 转基因鼠 每个鼠细胞中都含有外源基因 按孟德尔方式遗传 clonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞 3 微粒子轰击法 利用亚微粒的钨和金能吸附DNA 并将其包裹起来形成微粒 通过物理途径获得高速度 微粒瞬间既可进入靶细胞 达到转移目的基因的目的 而不损伤靶细胞 该方法可使目的基因在皮肤 肝 胰 胃及乳腺等细胞中表达 2 化学法 磷酸钙沉淀法 目的基因与磷酸钙等物质混合 形成沉淀的DNA微细颗粒 易通过细胞膜进入细胞内 并整合到受体细胞基因组中 在适当条件下得以表达 磷酸钙 DNA 混合微细颗粒 沉淀反应20 30min 细胞在沉淀物中暴露5 24h方法简单 但转化效率低 3 脂质体法 liposome 应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构 脂质体 包装外源基因 再与靶细胞融合 外源DNA导入靶细胞 使其表达 DNA细胞融合转化细胞PEG仙苔病毒 DNA 脂膜 4 同源重组法 同源重组 homologusrecombination 外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体 是将外源基因定位导入细胞的染色体上 单交换双交换 通过同源重组定点插入珠蛋白基因 XbaI BstXI XbaI neo XbaI BstXI neo 正常基因座位 带有珠蛋白基因的质粒 C 重组后 插入外源基因片段带有 neo基因 新霉素抗性基因 重组后的细胞在含有neo的培养基中生长 没有插入新基因的细胞死亡 将有重组的细胞筛选出来 5 病毒介导基因内转移 Viralmediatedtransfer 是通过病毒为载体 vector 将外源基因通过重组技术与病毒重组 然后去感染受体细胞 感染细胞 重组病毒 逆转录病毒 RNA 常用的病毒载体DNA病毒1 逆转录病毒 retrovirus 目前应用最多 最成功 病毒感染细胞后 其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝 插入宿主染色体形成前病毒 provirus 前病毒转录产生的正链既是病毒RNA 再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒 例如 小鼠白血病病毒 Mo MLV 基因组结构 LTRLTR gagpolenvU3RU5U3RU5U3 增强子 R 启动子 U5 转录起始位点 病毒包装信号 gag 核心抗原 pol 逆转录酶 env 外壳蛋白 逆转录病毒载体优点 高效感染宿主细胞 转染率可达100 病毒基因和所载的外源基因都可能表达 宿主范围广 可同时感染大量细胞并长期存留 缺点 病毒基因容量有限 一般只能插入7kb左右片段 病毒随机插入靶细胞基因组中 因病毒具有强大的启动子和增强子 能使插入点附近的基因过度表达或失活 插入的外源基因可能不适当的表达 逆转录病毒有致癌作用 可能使受体细胞癌变 根据逆转录病毒的缺点 人们有目的地将其改造 保留其优点 除去癌基因和病毒基因 保留LTR和 包装信号 6 受体载体转移法 将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽 配体 形成复合物 通过细胞内吞途径达到转移基因的目的 重组质粒 配体 细胞膜 复合物 三 靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞选择靶细胞的原则是 1 必须较坚固 便于体外培养和进行遗传技术操作 2 易于由人体分离又便于输回体内3 具有增殖优势 生命周期长 能存活几月至几年 或整个生命周期 4 易于受外源遗传物质转化 常见的靶细胞 外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞 地中海贫血 严重复合免疫缺陷病等基因治疗肝C 家族性高胆固醇血症 低密度脂蛋白病的基因治疗肌细胞 第三节基因表达的调控 一 基因表达调控的例征 一 不同条件下的基因激活1 细菌和其他单细胞生物中 不同条件下可形成不同的酶是广泛存在的现象 许多单细胞生物生活在水溶液中 溶液的温度 pH 培养基成分经常变化 细胞必须随时改变酶的成分 才能适应周围环境的变化 2 酵母菌小菌落在缺氧 有氧条件下 均酵解 大菌落无氧酵解 有氧进行有氧呼吸 3 人类的乙醇脱氢酶 乙醛脱氢酶都是诱导酶 一 基因表达调控的例征 二 不同发育阶段的基因活性多细胞生物的不同组织细胞的基因活性仍有很大差别 1 脊椎动物细胞内的乳酸脱氢酶的变化 LDH有五类 LDH1 LDH5 小鼠卵细胞中 只有LDH1 大约发育到第9天 主要是LDH5 再发育又出现LDH1 表明编码LDH1和LDH5的基因在不同时期分别处于打开和关闭的状态 2 人的血红蛋白组成的变化 血红蛋白用于氧的运输 在人发育的各个阶段中 血红蛋白的组成各不相同 早期胚胎 1 3个月 HbGower1 HbGower2 HbPotland三种血红蛋白 胎儿 HbF HbA新生儿 HbF70 80 HbA30 20 成人 HbA95 HbA22 5 HbF 1 二 原核类基因表达的调控 细菌和噬菌体的基因调控多数发生在转录水平上 操纵子是细菌主要的基因调控单位 即转录单位 1960年雅各布和莫诺共同提出了乳糖操纵子模型 其调控机理 乳糖操纵子 启动基因 P 操纵基因 O 结构基因 lacZ lacY和lacA三个 组成 操纵子的前边有一个调节基因R 乳糖操纵子的调节基因R能产生一种阻遏物 阻遏蛋白 当培养基中没有乳糖时 阻遏蛋白与操纵基因相结合 阻值RNA聚合酶的前进 mRNA转录就不能进行 乳糖代谢所需三种酶就不能合成 当培养基中有乳糖时 乳糖与阻遏蛋白结合 使阻遏蛋白构型发生变化 失去与操纵基因结合的能力 这时结构基因可转录出mRNA 进一步合成乳糖代谢所需三种酶利用乳糖 三 真核类基因表达的调控 一 真核生物与原核生物基因表达调控的差异 1 分子水平上的区别 真核细胞基因组的含量和基因数量远远高于原核细胞 并且DNA与组蛋白结合成核小体结构 同时与非组蛋白结合成染色体 2 细胞水平上的区别 真核细胞的染色体是被包在核膜内 转录和翻译分别在细胞核和细胞质中进行 3 个体水平上的区别 绝大多数真核生物都是复杂的多细胞有机体 个体发育过程复杂 不同组织细胞的基因 总是在不同的时空序列中被活化或阻遏 因此 真核细胞基因表达的调控是一种多层次的调控系统 它涉及到DNA水平 转录水平 转录后水平 翻译水平等多个调控点 三 真核类基因表达的调控 二 真核类基因不同层次的表达和调控类型1 染色体 DNA水平上的调控 1 染色质丢失 在发育过程中 体细胞丢失某些基因 这些基因永不表达 这是一种极端的不可逆基因调控 如小麦瘿蚊 马蛔虫 2n 2 染色体上排列许多着丝粒 在发育早期只有其中一个着丝粒起作用 当个体发育到一定阶段以后 除了将来发育成生殖细胞的体细胞外 其它体细胞均发生染色体断裂形成许多小染色体 其中含有着丝粒的小染色体在以后的细胞分裂中保存下来 没有着丝粒的在分裂中消失 致使最后85 的基因丢失 2 基因扩增 改变基因数量使之迅速增加而调节基因表达方式 即短期内细胞内大量产生某一基因拷贝的手段 如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的拷贝数可由平时的1500份急剧增加到200万份 它是适应胚胎发育时对核糖体的需求 3 转座因子 引起插入部位基因的开启和关闭 三 真核类基因表达的调控 2 转录水平上的调控 1 非组蛋白的调控作用 小鼠染色质重建实验说明非组蛋白对转录起着重要的作用 骨髓细胞染色质 分离组分 DNA 组蛋白 非组蛋白胸腺胞染色质 分离组分 DNA 组蛋白 非组蛋白骨髓DNA 骨髓组蛋白 胸腺DNA 胸腺组蛋白 混合 染色质 胸腺非组蛋白骨髓非组蛋白 转录胸腺RNA转录骨髓RNA 三 真核类基因表达的调控 2 转录水平上的调控 2 激素的调控作用 真核生物的细胞明显受激素的调控 在摇蚊 果蝇等双翅目昆虫幼虫的唾腺中的多线染色体上可看到一条条有特征的横纹 在幼虫 蛹期的各个发育阶段中 某些横纹变得疏松 膨大 这些疏松膨大区称为疏松区 疏松区出现一段时间后消失 它的出现有一定的时间程序 据测知 疏松区部位可以合成