血清胆固醇的定量测定

实验二 血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）,一、实验目的,1、学习并掌握磷硫铁法测定血清中总胆固醇含量的原理及操作；2、学会制备无蛋白血清 ；3、了解血清总胆固醇的正常值范围及临床意义 。,二、实验原理,胆固醇的分子结构,3,17,1,胆固醇主要存在于动物细胞，参与膜的组成，质膜中的含量比细胞器膜中的多。胆固醇也是血中脂蛋白复合体的成分；并与粥样硬化有关，它是动脉壁上形成的粥样硬化斑块成分之一。胆固醇也是类固醇激素和胆汁酸的前提。 1784年，从胆石中提取出胆固醇。,总胆固醇的测定方法： 磷硫铁法 化学比色法 醋酸酐法 邻苯二甲醛法 酶学方法（试剂盒）,用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与磷硫铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。,血清经无水乙醇处理后蛋白质被沉淀，胆固醇及其脂则溶解在无水乙醇中。在乙醇提取液中加入硫磷铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其脂与试剂反应形成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与胆固醇含量成正比，可于560nm 波长下进行比色测定。,正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110220mg/100mL。 胆固醇含量在400mg/100ml内，与A值成良好线性关系。,三、实验器材,1、人血清2、可见分光光度计3、台式离心机（4000r/min）4、离心管5、试管6、移液管。,四、实验试剂,1、10%三氯化铁溶液：10.0g FeCl36H2O 溶于浓磷酸中，定容至100ml；2、磷硫铁试剂(P-S-Fe 试剂)：取10%三氯化铁溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶内，加浓硫酸至刻度；3、胆固醇标准贮液：准确称量胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml；4、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得，此标准液含0.08mg/mL胆固醇。5、无水乙醇,五、操作,1、胆固醇的提取 吸取血清0.1ml置干燥离心管内，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇2.0ml，摇匀，10min后离心（3000r/min-6000r/min）5min，取上清夜备用。,2、比色测定 取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0ml（空白管），胆固醇标准溶液1.0ml（标准管），上述乙醇提取液1.0ml（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂1.0ml，摇匀，10min后，分别转移至比色杯内，用可见分光光度计在560nm处比色。,注：磷硫铁试剂须沿管壁缓缓加入，与乙醇液分成两层，立即迅速振摇20次，放置10分钟（冷却至室温）后，于560nm进行比色，以空白管调零读取各管吸光度。,六、计算,100ml血清中胆固醇的质量（mg） A1C0 m= 0.04100 A0,注意事项：,1、颜色反应与加磷硫铁试剂混合时的产热程度有关，因此，所用试管口径和厚度要一致；加磷硫铁试剂必须与乙醇分成两层，然后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；磷硫铁试剂要加一管混合一管，混合的手法、程度也要一致；混合时试管发热，注意勿使试管内液体溅出，以免损伤衣服、皮肤和眼睛。,2、所用试管和比色杯均须干燥，浓硫酸的质量很重要，放置日久，往往因为吸收水分，而使颜色反应降低。3、空白管应接近无色，如带橙黄色，表示乙醇不纯，应用去醛处理。,移液枪的使用,吸嘴的安装,散装吸嘴安装,盒装吸嘴安装,注意事项,错误操作：在将枪头套上移液枪时，很多人会使劲地在枪头盒子上敲几下。这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，严重的情况会将白套筒折断。正确操作：将移液器垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。,设定容量,注意事项,1、移液器要在规定的容量内使用，切勿超量程使用，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液器。 2、调整容量时，如果从大到小时，可以直接调到想要的容量；如果从小到大时，一定要调超三分之一圈，然后再调回来，这样做可以使弹簧完全放开,而且移液器总是在顺时针运转可以延长移液器的使用寿命。,移液,1.连接恰当的吸嘴；2.按下控制钮至第一档（在空气中）； 3.将移液器吸嘴垂直进入液面下1- -6mm（视移液器容量大小而定）注：为使测量准确可将吸嘴预洗3 次，即反复吸排液体3 次。,4.使控制钮缓慢滑回原位； 5.移液器移出液面前略等1- -3秒；1000ul 以下停顿 1 秒；5- -10ml停顿2- -3秒6.缓慢取出吸嘴，确保吸嘴外壁无液体。,排液,1.将吸嘴以一定角度抵住容量内壁；2.缓慢将控制钮按至第一档并等待约13秒；3.将控制钮按至第二档过程中，吸嘴将剩余液体排净，可反复在1,2档间按压，确保排净；4.慢放控制钮；5.按压弹射键弹射出吸嘴。,移液,一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、活性液体、易起泡液体或极微量的液体。其操作是先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有残留液体的枪头，弃之。,移液枪的养护及注意事项,1.当移液器吸嘴有液体时切勿将移液器水平或倒置放置，以防液体流入活塞室腐蚀移液器活塞。 2.移液器使用完毕后，把移液器量程调至最大值，且将移液器垂直放置在移液器架上。3.如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物。,4.平时检查是否漏液的方法：吸液后在液体中停1- -3 秒观察吸头内液面是否下降；如果液面下降首先检查吸头是否有问题，如有问题更换吸头，更换吸头后液面仍下降说明活塞组件有问题，应找专业维修人员修理。 5.吸取液体时一定