《分子生物》PPT课件.ppt

第二章细胞 生物大分子和核酸 第一节细胞和生物大分子 Prokaryoticcell Protein DNA RNA Eukaryotescell 典型原核细胞示意图 类核 菌毛 微丝 鞭毛 微管蛋白 1细胞1 1原核细胞 某些原核细胞的形状 螺菌 螺旋体 鱼腥藻属 一种蓝藻细菌 大芽孢杆菌 大肠杆菌 葡萄球菌 立克次氏体 三种支原体 典型真核细胞示意图 ControlstheshapeandmovementofthecellOrganizessomemetabolicfunctions 1 2真核细胞 真核细胞的三维结构图形 1 3原核细胞与真核细胞的比较 1 原核细胞与真核细胞结构与功能的比较 2 原核细胞与真核细胞遗传装置与基因表达方式的比较 2 病毒 virus 烟草mosaic病毒 病毒是什么 一种不具备细胞结构的生物体 只能寄生在宿主细胞中才能生存 病毒一般包含核酸以及外壳蛋白 有些动物的病毒的外面也偶尔覆盖一层细胞膜 病毒进入宿主细胞之后 利用宿主的合成机制复制出大量的后代 3Macromolecules 生物大分子 ProteinNucleicacidsPolysaccharides 多糖 LipidsComplexmacromolecules MBcourse X Biochemistry Immunology MolecularBiologyCourse 第二节核酸 Nucleicacids 一 核酸的发现 种类 分布与功能 二 核酸的化学组成 三 核酸的分子结构 四 核酸的重要理化性质 1871F Miesch提取到核酸 DNA晶体的X射线衍射照片 1953 1953DNA双螺旋结构 1944Avery证实基因是DNA 1950Chargaff定律A T C G 1 一 核酸的发现 种类 分布与功能 1 核酸的发现 JamesWatsonandFrancisCrick andthemodeltheybuiltofthestructureofDNA 提出双螺旋结构的依据 各种生物物理资料 DNA纤维中的水含量 X ray衍射图谱 RosalindFranklin完成 碱基比 Chargaff完成 模型构建 Watson Crick完成 RosalindFranklin RosalindFranklinBorn London England July25 1920AkeyandessentialcontributortothediscoveryofthefamousdoublehelixstructureisRosalindFranklin SheplayedacriticalroleinthedevelopmentsthatledtothefamousdiscoverybyDr WatsonandDr Crickin1953 Manysourcessuggestthatifshewerealivein1962 shewouldhavebeenawardedtheNobelPrizealongwithDrs Watson CrickandWilkins AfterKing sCollege Dr Franklin smovedontoalabattheUniversityofLondonwhereshestudiedthestructureofvirusesanddidsomeofherbestwork Inmid 1956Dr Franklinwasdiagnosedwithovariancanceranddiedattheyoungageof37 2 核酸的种类与分布 核糖核酸 ribonucleicacid RNA 转移RNA transferRNA tRNA 信使RNA messengerRNA mRNA 核糖体RNA ribosomalRNA rRNA 小分子细胞核RNA snRNA 染色质RNA chRNA 反义RNA antisenseRNA 双链RNA dsRNA 细胞质小RNA scRNA 具有催化活性的RNA ribozyme 各种病毒RNA 2 1核酸的种类 RNA DNA 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleicacid DNA 2 2核酸的分布 3 核酸的功能 核酸的功能是什么 DNA是主要的遗传物质 转化作用 遗传信息的载体 负责遗传信息的贮存和发布 RNA的功能 1 参与蛋白质的合成rRNA 75 80 tRNA 10 15 mRNA 2 5 2 遗传物质3 具有生物催化剂功能 二 核酸的化学组成 1 核酸的元素组成基本元素 CHONP 核酸的元素组成有两个特点 1 一般不含S 2 P含量较多 并且恒定 9 10 因此 实验室中用定磷法进行核酸的定量分析 DNA9 9 RNA9 5 2 核酸的分子组成 核酸 DNA和RNA 是一种线性多聚核苷酸 它的基本结构单元是核苷酸 核酸 核苷酸本身由核苷和磷酸组成 而核苷则由戊糖和碱基形成 3核酸的结构 3 1碱基 AG 腺嘌呤鸟嘌呤嘌呤Adenineguanine UCT 尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶uracilcytosinethymine 嘧啶 注意嘌呤和嘧啶结构之间的差别 嘧啶 pyridine 单环 嘌呤 purine 双环 核酸中除了5类基本的碱基外 还有一些含量甚少的碱基 称为稀有碱基 组成核酸还有许多稀有碱基 3 2核苷 3 2 1戊糖 组成核酸的戊糖有两种 DNA所含的戊糖为 D 2 脱氧核糖 RNA所含的戊糖则为 D 核糖 3 2 2核苷 核苷由戊糖和碱基缩合而成 嘌呤的N9或嘧啶的N1与戊糖C 1 OH以C N糖苷键相连接 3 3核苷酸 核苷酸是核苷的磷酸酯 作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5 磷酸 脱氧核糖核苷和5 磷酸 核糖核苷 磷酸二酯键与DNA链的共价结构 3 4磷酸二酯键 一条多聚核苷酸由脱氧核糖和磷酸由共价键相间连接 一个脱氧核苷酸的3 端与下一个的5 端通过磷酸二酯键连接 3 5DNA序列 DNA的一级结构 DNARNA 通过3 5 磷酸二酯键相连 阅读方向为5 3 表示方法 1 结构式 2 线条式 3 字母式 3 6DNA双螺旋结构 二级结构 A与T C与G配对 以氢键结合 两条主链由脱氧核糖和3 5 磷酸二酯键交互连接而成 碱基位于内侧 双螺旋结构的特点 双链反向平行 以5 3 为正方向 从两端看结构相同 双螺旋体类似于盘旋的楼梯 碱基对如同踏板 碱基堆积作用维持着螺旋结构的稳定性 直径 2 0nm 螺距 3 4nm 每匝10bp 10 5bp 基本参数 每一碱基对比另一对沿轴旋转36 大沟含较多信息 为复制 转录部位 小沟具一定调节功能 MajorGroove MinorGroove 3 7DNA结构的多样性 A B Z Handedness Pitch B DNA 含水量92 脱水后变形为A DNA 含水75 相邻磷酸间距缩小 每匝增为11bp A DNA 通常DNA在细胞中以B DNA形式存在 但可能发生改变 DNA RNA杂交分子呈A型 总体变得宽而短 大沟变细 加深 小沟变得宽而浅 Z DNA与B DNA的比较最大区别 Z DNA为左旋 由部分碱基反转平面所致 Z DNA 螺距4 5nm 每对碱基上升0 37nm 每匝12bp 主链变的不平滑 从之字形 以Zig Zag得名为Z DNA 可能与基因的调控有关 三种DNA结构特性比较 3 8超螺旋 supercoil superhelix DNA的高级结构 3 8 1定义 DNA的高级结构指DNA分子 双螺旋 通过扭曲和折叠所形成的特定构象 包括不同二级结构单元间 单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征 超螺旋是DNA高级结构的主要形式 可分为正超螺旋和负超螺旋 1965年首次发现绝大多数的原核生物DNA为共价闭合环状DNA covalentlyclosedcircle cccDNA 经进一步螺旋化 成为超螺旋结构 之后发现 几乎所有的DNA分子 包括线形分子 具超螺旋结构 3 8 2超螺旋的形成原因 分子内发生扭转时 张力导致超螺旋的形成 L linkingnumber 连接数 一股链绕另一股链盘绕的次数 在闭合分子双链的共价键不发生断裂时保持不变 为分子的拓扑学常数 超螺旋的形成原因 了解 拓扑学解释 T twistingnumber 盘绕数 代表一股链绕旋转轴所做的完整的旋转数 即DNA双螺旋的匝数 等于碱基数 每匝碱基数 W writhingnumber 超盘绕数 代表双螺旋轴在空间上的转动数 即直观上的超螺旋数 拓扑异构体 Topologicalisomers 碱基顺序相同 但连接数不同的分子 L T W 正超螺旋 positivesupercoil DNA扭曲方向与双螺旋方向相同 形成正超螺旋 双链紧缠 DNA的几种超螺旋的状态 负超螺旋 negaivesupercoil DNA扭曲方向与双螺旋方向相反 形成正超螺旋 双链松缠 两种超螺旋的自由能均高于松弛状态 天然原核生物DNA都呈现哪一种超螺旋形式 为什么 天然原核生物呈现负超螺旋 DNA负超螺旋易于解链 在DNA复制 重组和转录等过程中都需要两条链解开 所以负超螺旋利于这些功能的实施 EB EB插入DNA碱基之间 在体外可形成正超螺旋 如加入溴化乙锭 EtBr EB 可引入正超螺旋 嵌入剂 质粒的松弛状态和超螺旋状态 超螺旋分子的电泳迁移速率提高 超螺旋对分子迁移的影响 4 1RNA一级结构的特点 4 RNA的分子结构 RNAstructure RNA一级结构研究最多的是tRNA rRNA以及一些小分子的RNA 组成RNA的核苷酸也是以3 5 磷酸二酯键连接 4 2RNA的高级结构特点 RNA是单链分子 因此 在RNA分子中 并不遵守碱基种类的数量比例关系 即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数 RNA分子中 部分区域也能形成双螺旋结构 类似A DNA双螺旋结构 不能形成双螺旋的部分 则形成突环 这种结构可以形象地称为 发夹型 结构或茎环结构 四 核酸的理化性质 4 1化学性质 碱基堆积力 stackinginteraction 核酸分子稳定性的根源 氢键 在蛋白质和核酸中 氢键并不能使之稳定 其对大分子的特殊结构有作用 比如 螺旋 折叠 DNA双螺旋等 4 1 1核酸的稳定性 疏水的碱基堆积起来 使水分子排除在外 从能量的角度来讲最为稳定 4 1 2酸效应 PH 3 4 连接嘌呤和核糖的糖苷键断裂 产生脱嘌呤核苷 强酸 高温 完全水解碱基 核糖 脱氧核糖和磷酸 应用 Maxam GilbertDNA化学测序法 4 1 3碱效应 PH 7 8 DNA结构的改变较为温和 subtle 较高的PH可以使碱基发生互变异构 tautomeric 也会导致变性 denatured 发生 1 DNA 2 RNA 由于RNA存在2 OH 在较高的PH值条件下RNA会发生水解 4 1 4化学变性 尿素 H2NCONH2 甲酰胺 HCONH2 破坏水溶液的氢键作用 碱基的疏水效应削弱 核酸变性 4 1 5DNA的浮力密度 buoyant 1 66 0 098 G C 纯化DNA 平衡密度梯度离心 equilibriumdensitygradientcentrifugation 或等密度梯度离心 isopycniccentrifugation 4 2核酸的光谱学和热力学特性 4 2 1紫外光吸收 核酸因含有共轭的苯环而吸收紫外光 DNA和RNA的最大紫外光吸收波长为260nm max 260nm 应用 DNA检测 定量和纯化 4 2 2减色效应 Hypochromicity 单一的核苷酸在260nm A260 的光吸收值最大 其次是单链DNA ssDNA 或RNA 而双链DNA dsDNA 最小 即dsDNA相对于ssDNA是减色的 hypochromic 由于碱基在疏水环境中的堆积所造成 4 2 3核酸定量 核酸的消光系数 1mg mldsDNAA260 20 ssDNA RNAA260 25 消光系数的决定因素 1 消光系数表示的是不同碱基吸光值的总和 Pu Py 2 减色性 与核酸的二级结构有关 4 2 4DNA的纯度 A260 A280 dsDNA 1 8 PureRNA 2 0 Protein 0 5 a 双链DNA和RNA的热变性 b 快速和慢速降温下的DNA复性 4 2 5热变性 加热可以破坏DNA或RNA双链区的氢键 增色效应 hyperchromaticeffect DNA双链分离时 伴随着在260nm处的吸光值的增加 增加的过程为慢 快 慢的S形曲线 增加到中点时的温度叫作熔 融 解温度 meltingtemperature 影响变性的因素溶液离子强度 甲酰胺 尿素 pH DNA碱基组成 Fig 4 2 6复性 快速降温只形成局部区域的双链DNA 慢速冷却提供了足够的时间使得互补链能够相互配对 样品可以形成完全的双链DNA 退火 Annealing 杂交 Hybri