临床血液检验仪器

现代医学仪器,第三章 第六节 血细胞分析仪( Blood Cell Analyzer ) 南京医科大学第一临床医学院 临床医学工程处 刘坚,血细胞分析仪概述,血细胞分析仪 ( Blood Cell Analyzer ) 是指对 一定体积全血内血细胞异质性进行自动分析的 常规检验仪器。血液分析仪主要完成以下两大功能: 血细胞计数：红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白。 血细胞分类：白细胞中的 淋巴、中性、嗜酸、嗜碱、 单核、 幼稚细胞；红细胞中的 网织红细胞。根据计数/分类的测定值计算间接测定值 红血球容积比 (HCT)、平均红血球血红蛋白含量 (MCH)、 血小板容积比 (PCT)，等等,血细胞分析仪概述,1947年 Coulter 发明了小孔电阻抗法 通过测量细胞的体积大小对 细胞进行分类计数 主要是用来计数红、白细胞 该技术一直被各种血液分析 仪沿用至今 1953年库尔特家族研制出全 世界第一台血细胞计数仪： Model A,Wallace H. & Joseph R. Coulter,血细胞分析仪概述,血细胞计数 (Blood count) 早期的血液分析仪主要用来计数红、白细胞 全血细胞计数(Complete Blood cell Count) 增加光电比色系统用来同时测定血红蛋白 血小板可在同一仪器上与红细胞一起计数 利用直接测量到的项目运算得到间接计算 项目（如血球压积等参数） 不包括白细胞分类计数 测定标本采用机外人工处理的预稀释方式,血细胞分析仪概述,白细胞分类计数 (Differential Leukocyte Cell Count) 带电脑的显微镜下辨认细胞的图象识别技术 效率低，受制片、染色技术的影响大 在计数细胞数不多时，重复性较差 没有得到普遍推广 阻抗法仪器检测白细胞“二分群、三分群” 仪器内部结构的进一步完善 微处理器分辨力的进一步提高 特殊溶血剂的应用 无法对细胞内部结构进行分析，准确性有限,白细胞分类计数 (Differential Leukocyte Cell Count) 检测白细胞从二分群、三分群发展到五分群 除了体积测量之外增加了多种手段（联合检测法） 激光散射、激光激发荧光检测法 射频（高频）传导检测法 特殊溶血剂检测法 多角度激光、偏振光散射检测法 细胞化学染色检测法 在实际仪器中至少采用两种以上方法联合对 白细胞进行五分类。,血细胞分析仪概述,血细胞分析仪概述,白细胞分类计数 (Differential Leukocyte Cell Count) 五分群血液分析仪提供四十余项实验参数 全血细胞计数（CBC）: 白细胞总数（WBC） 红细胞（RBC） 红血球容积比（HCT） 血红蛋白（HGB） 平均红血球体积（MCV） 血小板（PCT） 平均红血球血红蛋白含量（MCH）； 白细胞分类（DIFF ）： 淋巴细胞(LYM) 中性粒细胞(NEUT) 单核细胞(MONO) 嗜酸细胞 (EOS) 嗜硷细胞 (BASO) 网织红细胞分类、计数（RETIC）,五分群血液分析仪的基本检查项目,血细胞分析仪分型,按自动化程度分类： 半自动血细胞分析仪；全自动血细胞分析仪； 血细胞分析工作站；血细胞分析流水线；按检测原理分类： 电容型、光电型、激光型、电阻抗型、 联合检测型 、干式离心分层型、无创型、按对白细胞分类的水平分类： 二分群、三分群、五分群、 五分群 网织红（红细胞）,小孔电阻抗法是利用血细胞混悬液中血细胞的电阻 大于电解液溶液（稀释液）电阻的特性，当血细胞 通过小孔时引起小孔两端电阻抗增大的原理而进行 血细胞计数和体积测定。 小孔电阻抗法能够进行白细胞、红细胞、血小板计 数及体积的测定。 小孔电阻抗法在对白细胞分类上只能将白细胞按体 积大小分为三个亚群，故分析精度较差。（164页）,测定原理( Principle )电阻抗法（小孔阻抗法、白细胞三分群）,小孔电阻抗法基本原理,采用Coulter原理， 即小孔电阻抗法 装有宝石小孔的 小孔管 置与小孔管内外 的铂金电极 两电极间的恒流电源 小孔上端的恒定负压,小孔电阻抗法基本原理,测定原理( Principle )电阻抗法（小孔阻抗法、白细胞三分群）,测定原理( Principle )电阻抗法（小孔阻抗法、白细胞三分群）,血细胞通过小孔， 排开等体积电解液。 小孔中的电解液电阻变大，引起产生等比例增大的 电压脉冲。 电压脉冲的个数与细胞个数相当，脉冲幅度与细胞 体积成正比。 将脉冲送入相应的计数通道，计算得到某类细胞个数。,小孔电阻抗法基本原理,测定原理( Principle ) 由检测器产生的脉冲信号经计算机处理后以体积 直方图显示。直方图可以显示特定细胞群中的细 胞体积和细胞分布情况。(164页）,通道内计数,白细胞“三分群”型血液分析仪：,小孔电阻抗法基本原理,256个计数通道 1.6fl/每通道,1fl（1立方微米） =10-15升,由检测器产生的脉冲信号经计算机处理后以体积 直方图显示。直方图可以显示特定细胞群中的细 胞体积和细胞分布情况。 在进行血细胞分析时，白细胞和血红蛋白为一个 检测通道（小孔直径为100m)；红细胞和血小板 为一个检测通道(小孔直径为70m）。,小孔电阻抗法基本原理,测定原理( Principle )电阻抗法（小孔阻抗法、白细胞三分群）,白细胞的五种类型,小孔电阻抗法基本原理,正常人外周血中的5种白细胞，最多的是嗜中性，次为淋巴细胞，其他3种在通常情况下加起来不超过10。淋巴细胞与嗜中性细胞体积相差较大，其他3种体积相差不多。,测定原理( Principle )白细胞及血红蛋白检测,白细胞的计数与分类： （白细胞/血红蛋白通道） 血液样品 + 稀释液 + 溶血剂 白细胞的计数与分类 血红蛋白测定： （白细胞/血红蛋白通道） 血液样品 + 稀释液 + 溶血剂 + 转化剂 氰化血红蛋白 氰化血红蛋白浓度 血红蛋白浓度 比色法测量,小孔电阻抗法基本原理,测定原理( Principle )白细胞及血红蛋白检测,由于血小板的体积小于红细胞，两者在同一测量通道 中进行。 由于血液中红细胞的总数远大于白细胞，检测样品经 二次稀释后直接进入小孔计数。 检测结果同样以直方图形式显示。 小孔电阻抗法不能 对红细胞中的网织 红细胞进行测量。,小孔电阻抗法基本原理,测定原理( Principle )红细胞及血小板检测,单纯依靠细胞体积大小来进行白细胞五分类是难 以做到的。必须采用一些其他检测手段联合应用来进 行白细胞五分类。（联合检测型）常用方法有： 高频电磁波（或称射频）传导法 细胞化学染色法 特殊溶血剂法 激光散射法（测不同角度的散射及激发光） 其白细胞总数、红细胞、血小板及血红蛋白的测 定方法仍基本沿用“三分类”型分析仪的方法。,联合型检测法基本原理,测定原理( Principle )联合型检测法（白细胞五分群）,绝大多数五分类血细胞分析仪在检测通道上都采用了流式细胞分析技术。 流式细胞分析技术的检测光路可分为鞘流通道、激发光源（多为激光）、散射光检测、吸收光检测、荧光检测等几个方面。 在白细胞五分类型血液分析仪中对网织红细胞 一般也采用单独的激光流式细胞分析通道进行 检测。,测定原理( Principle )联合型检测法（白细胞五分群）,联合型检测法基本原理,五分类血细胞 分析仪白细胞 分类结果均采 用散点图的形 式来显示。 红白细胞总数 血小板仍采用 直方图显示。,联合型检测法基本原理,测定原理( Principle )散点图(Scattergram),联合型检测法基本原理,白细胞二维散点图,二维散点图及直方图,测定原理( Principle )散点图(Scattergram),图中纵坐标为 体积;横坐标为 吸光度。 各种不同类型的白细胞根据其体积与吸光度的的数值标记在二维坐标的相应位置。,联合型检测法基本原理,测定原理( Principle )散点图(Scattergram),联合型检测法基本原理,图中三维坐标分别为V、C、S，各种不同类型的白细胞根据其VCS的值，标记在三维坐标的相应位置。,白细胞三维散点图,测定原理( Principle )散点图(Scattergram),（1）电阻抗(DC)、高频传导(RF)和激光散射(Scatter) 联合检测法：即所谓“VCS 技术”。（Coulter公司） V 代表体积(Volume)， 采用电阻抗法计数血 细胞和测量其体积； C 代表传导性 (Conductivity)，主要 测量细胞内部的结构， 细胞内核浆比例，质 粒的大小和密度。,GENS System ,（1）电阻抗(DC)、高频传导(RF)和激光散射(Scatter) 联合检测法：即所谓“VCS 技术”。（Coulter公司） S 代表散射(Scatter)， 用于测量细胞表面不 同的结构及颗粒。 单一通道上同时用这 三种方法对同一白细 胞进行测量，在三维 的图像上将各细胞较 好地分开，准确分类。,Total CellVolume,Coulter Principle,DirectCurrent,细胞体积,Conductivity Principle,HighFrequencyCurrent,核/浆比例,颗粒,Light Scatter Principle,Laser,细胞表面特征,细胞体积,（2）激光散射和细胞化学染色联合检测法 ： ( Bayer 公司ADVIA120）、(Abx公司 Pentra120) 稀释液中加入髓过氧化物酶 (MPO)的底物，过氧化氢和 色原可使含MPO的细胞胞浆 染色。由于不同种类白细胞 含MPO不同，因此可以通过 染色的深浅加以区别。 加入特殊溶血剂使得除嗜碱 细胞以外的细胞全部裸核化。,ADVIA 120,（2）激光散射和细胞化学染色联合检测法 ： ( Bayer 公司ADVIA120）、(Abx公司 Pentra120) 用两个流式通道进行测定， 髓过氧化物酶通道( 卤素灯 光源，测吸光度与散射光)； 嗜碱性核叶通道（激光光 源，测高角度散射光与低角 度散射光)。通道还同时进行 红细胞、血小板及网织红细 胞的测定。,Pentra 120,（3）多角度激光偏振光散射检测电阻抗联合检测法： （Abbott 公司CD-3500） 完全用激光散射方 法进行白细胞分类， 其测散射光所用的 角度为四个。即 0o、 10o、90o 和90o 消偏 振 (depolarized) 。 电阻抗法用于计 数白细胞总数。,CELL-DYN 3500,（3）多角度激光偏振光散射检测电阻抗联合检测法： （Abbott 公司CD-3500） 完全用激光散射方 法进行白细胞分类， 其测散射光所用的 角度为四个。即 0o、 10o、90o 和90o 消偏 振 (depolarized) 。 电阻抗法用于计 数白细胞总数。,CELL-DYN 3500,（4）电阻抗和射频传导联合检测特殊溶血剂法： （Sysmex公司 NE-8000、SE-9000 ） 淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞检测通道(DC+RF) 嗜碱性细胞检测通道 （特殊溶血剂 ） 嗜酸性细胞检测通道 （特殊溶血剂 ） 幼稚细胞检测 通道(硫化氨基酸),SE-9000,计数网织红细胞的方法： 在红细胞稀释液中加入可染RNA的荧光染料， 经激光激发后在检测器中加以计数。 各公司生产的仪器计数网织红细胞时基本都 采用这种方法。 多数仪器中网织红细胞的测定使用单独的激 光检测通道，不少仪器生产厂家将此功能做 成独立仪器或选购件供用户选择。,血细胞分析仪检测流程,血细胞分析仪工作流程图,维护工作的基本要点 电路系统（仪器供电电压、各种传感器状态） 流体系统（各种管道、电磁阀、正负压力） 机械运动（加样针、注射器、旋转阀） 比色通道（光源灯、滤光片） 维修软件（各点电压检测、运动部件检测） 基本要点可能因为各种仪器的型号不同而不尽 适用，可依据具体情况来分别对待，但经过仔细观 察和深入了解一定可以掌握对自己使用的机型的基 本维护。,现代医学仪器,第三章 第七节 流式细胞分析仪 （Flow cytometer） 南京医科大学第一临床医学院 临床医学工程处 刘坚,流式细胞分析仪概述,流式细胞分析仪（flow cytometer）是集计算机技术、 电子物理技术、光电测量技术、激光技术、流体力学技 术、细胞化学技术、细胞免疫学技术于一体的高科技细 胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry) 是利用流式细胞仪对处 于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒 可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99% 以上）的技术。流式细胞仪在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、 病理学、遗传学、临床检验等学科中得到广泛应用。,流式细胞仪基本原理,待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后加 压进入充满鞘液的流动室。鞘液压力与样品流压力差异达到一定比例时， 鞘液包裹着样品流中细胞排成单列逐个经过激 光聚焦区。通过激光检测区的细胞受激光照射，产生散射 光；部分被标上特异性荧光染料的细胞，产生 特定波长的荧光。,流式细胞仪基本原理,通过一定波长选择通透性的滤光片，将散射光、 不同波长的荧光信号区分开来，并送到不同的 光电检测通道。经过一系列信号转换、放大，数字化处理，就 可以在计算机上直观的得到染上各种荧光染料 的细胞各自的百分率。细胞分选功能可以将具有某种特征的细胞分选 出来，以便进一步培养、研究。,流式细胞仪基本结构,(一）流动室及液流驱动系统（二）激光光源及光束形成系统（三）光学系统：透镜,滤光片,小孔,聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号 (四）信号检测与存储、显示、分析系统：光电倍 增管（PMT）、补偿电路。荧光信号转换为 电信号，并将信号放大（五）细胞分选系统,FCM基本结构图解,流式细胞仪基本结构,流动室及液流驱动系统,流动室与液流驱动系统,空气泵压力传感器压力调节器石英流动室,流式细胞仪基本结构,流动室及液流驱动系统,空气泵压力传感器压力调节器石英流动室,流式细胞仪基本结构,激光光源及光束形成系统,氩离子激光器 （Argon）半导体激光器 （He-Ne）紫外UV激光器 （He-Cd）按功率大小可 分为水冷/空冷到达流动室前 经透镜聚焦,流式细胞仪基本结构,激光光源及光束形成系统,氩离子激光器 （Argon）半导体激光器 （He-Ne）紫外UV激光器 （He-Cd）按功率大小可 分为水冷/空冷到达流动室前 经透镜聚焦,流式细胞仪基本结构,光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号,流式细胞仪基本结构,光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号,LP-长通滤光片,SP-短通滤光片,BP-带通滤光片,DLP、DSP 双色性长通 短通滤光片,流式细胞仪基本结构,光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号,流式细胞仪基本结构,信号检测与存储、显示、分析系统：光电倍 增管（PMT）、补偿电路。荧光信号转换为 电信号，并将信号放大,前向角散射光检 测（FSC）采用 光电二极管侧向角散射光检 测（SSC）采用 光电二极管荧光检测（FL） 采用光电倍增管,流式细胞仪基本结构,信号检测与存储、显示、分析系统：光电倍增 管( PMT )、补偿电路、将荧光信号转换为电信 号，并将信号放大，处理分析。,Log,荧光信号的线性测量 与对数测量荧光信号的面积测量 与宽度测量荧光光谱的重叠校正,流式细胞仪基本结构,信号检测与存储、显示、分析系统：光电倍增 管( PMT )、补偿电路、将荧光信号转换为电信 号，并将信号放大，处理分析。,荧光信号的线性测量 与对数测量荧光信号的面积测量 与宽度测量荧光光谱的重叠校正,流式细胞仪基本结构,信号检测与存储、显示、分析系统：光电倍增 管( PMT )、补偿电路、将荧光信号转换为电信 号，并将信号放大，处理分析。,数据存储采用 列表排队方式数据显示通常 有一维直方图 二维散点图、 等高线图、密 度图等,流式细胞仪基本结构,信号检测与存储、显示、分析系统：光电倍增 管( PMT )、补偿电路、将荧光信号转换为电信 号，并将信号放大，处理分析。,数据存储采用 列表排队方式数据显示通常 有一维直方图 二维散点图、 等高线图、密 度图等,SS,FS,流式细胞仪基本结构,细胞分选系统,捕获管分选和 静电分选水滴形成部件分选逻辑电路水滴充电及偏转,捕获管分选,流式细胞仪基本结构,细胞分选系统,捕获管分选和 静电分选水滴形成部件分选逻辑电路水滴充电及偏转,细胞分选系统,捕获管分选和 静电分选水滴形成部件分选逻辑电路水滴充电及偏转,流式细胞仪主要性能指标,流式细胞仪可分为科研型（大型机） 和临床型（台式机）两种类型,流式细胞仪主要性能指标,流式细胞仪可分为科研型（大型机） 和临床型（台式机）两种类型,流式细胞仪主要性能指标,流式细胞仪可分为科研型（大型机） 和临床型（台式机）两种类型,流式细胞仪主要性能指标,流式细胞仪可分为科研型和临床型两种类型（台式机）,流式细胞仪主要性能指标,流式细胞仪可分为科研型（大型机） 和临床型（台式机）两种类型流式细胞仪会在硬件上不断更新，采用更新的器件（如半导体激光、大规模集成电路），以实现小型化；用数字电路取代模拟电路，充分发挥微处理器的功能以实现简单化；在软件上提高数据自动分析能力，充分发挥图形界面的优点， 使操作更加简便。,流式细胞仪主要性能指标,流式细胞仪可分为科研型（大型机） 和临床型（台式机）两种类型流式细胞仪会在硬件上不断更新，采用更新的器件（如半导体激光、大规模集成电路），以实现小型化；用数字电路取代模拟电路，充分发挥微处理器的功能以实现简单化；在软件上提高数据自动分析能力，充分发挥图形界面的优点， 使操作更加简便。,谢谢！,流式细胞仪小结 174页,待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后加 压进入充满鞘液流的流动室。(细胞染色）鞘液流压力与样品流压力差异达到一定比例时，鞘液包裹着样品流中细胞排成单列逐个 经过激光聚焦区