治疗性血管新生及中西医结合探索

1,治疗性血管新生及中西医结合探索Therapeutic Angiogenesis and the exploration of Chinese Integrative Medicine,2,冠心病的治疗，解决供需平衡，不是减少心肌耗氧，就是增加冠脉供血血管新生背景与概念血管新生的研究方法促进治疗性血管新生的方法麝香保心丸促血管新生研究,提 要,3,治疗性血管新生研究背景,Folkman在1970年代早期发现血管新生：肿瘤生长:血管生长因子与血管新生相关1983年, Kumar 等发现：心肌梗塞后有“血管生长因子” 1980年代中期，确定并纯化了多种与血管新生有关的多肽1994年 Jeff Isners 实验室倡导将血管生成用于心血管研究中。Ellis Ungers 实验室发现应用促血管生成的蛋白质可以改善冠脉侧支。,Judah Folkman （1933-2008）美国国家科学院院士，于70年代提出了肿瘤新生血管学说，该理论后被心血管领域应用于促血管新生研究,4,侧支血管形成的种类,微血管生长（Angiogenesis）血管发生（Vasculogenesis）动脉生成（Arteriogenesis） 三者的机理是不同的,5,血管新生(angiogenesis),相当于废墟重建 在现有血管上通过芽生(sprouting)、分枝方式形成成熟的血管，由初级网状血管结构到复杂网状血管结构的过程。 血管内皮细胞基底膜降解、细胞外基质消化吸收。 内皮细胞向血管生长刺激物方向移行和增殖。 移行的血管内皮细胞伸展，彼此相连形成血管芽孢。 血管内皮细胞增殖使中空的管腔延长。,6,血管发生（Vasculogenesis）,相当于发生过程的重复血管增生来源于中胚层前体的内皮细胞原位分化、增殖形成初级毛细血管丛。血管重构初级毛细血管形成互相连接、分支众多、成熟的血管结构。,7,动脉生成（Arteriogenesis）,相当于休闲动脉的动员原有的侧支血管正常心脏冠脉间存在的交通吻合血管，直径20至200m ,呈薄壁样管状结构，通常状态下呈关闭状态。开放不仅仅是一个被动过程，开放后会出现一系列细胞生长因子分泌、DNA合成和细胞增殖 等血管主动生长过程。,8,治疗性血管新生（Therapeutic Angiogenesis ）,手术搭桥（冠脉旁路血管移植术）药物搭桥（药物促进的治疗性血管新生）,通过药物、基因治疗或其他手段促进冠状动脉的血管新生，以达到改善心肌缺血症状和患者预后的目的。,9,治疗性血管新生的意义,10,血管新生的研究方法和进展,11,筛选模型鸡胚绒毛尿囊膜实验,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验 目前血管新生药物初步研究主要采用CAM 模型。CAM 作为一项研究体内血管效应的技术具有实验材料易得、操作简便、实验周期短、结果易于观察等优点，尤其适用于血管效应药物的初步筛选。,12,动物缺血模型,兔、鼠选择性冠状动脉结扎、栓塞造成动物缺血模型，给予干预后观察梗死周边区血管新生情况。,大鼠心梗模型的制备,13,慢性缺血模型,3周后左冠造影,狭窄明显、前向血流缓慢,14,血管内皮细胞培养,血管内皮细胞培养：因为人脐静脉(HUV) 在某些方面具有与动脉生物学特征相似的优点，较之动物血管内皮更符合人体情况。增殖：MTT比色法迁移：Transwell小室体外成血管：体外血管生成试剂盒分泌：培养液内No、VEGF,人脐静脉内皮细胞培养,15,血管生长因子/抑制因子,干预因素对组织生长因子/抑制因子的影响生长因子：VEGF、 bFGF，TGF、促血管生成素-1（Ang-1）抑制因子：血管新生抑制素、内皮细胞抑制素、组织金属蛋白酶抑制剂、血栓反应素-1，2 (thrombospodin-1&2，TSP-1&2)、血小板因子-4(PF-4)等,缺血心肌中的VEGF染色颗粒,16,促进治疗性血管新生的方法,促血管生长因子的应用激光心肌血运重建（激光打孔）干细胞移植药物干预,17,外源性输注生长因子,目前，研究最广泛的血管生成生长因子家族为VEGF和FGF。给急性心肌梗死动物冠脉内注射bFGF，心肌梗死的面积显著缩小，缺血或梗塞心肌内毛细血管及小动脉数目增加。 VEGF是一种内皮细胞特异性有丝分裂原和活体血管新生诱导物。VEGF因其对内皮细胞作用的特异性而广泛应用于实验性肢体及心肌缺血的研究。,18,导入生长因子基因,近来病毒介导的基因转染已作为一种血管形成生长因子释放的方法应用于慢性缺血动物模型。 VEGF基因，PDGF基因 将含VEGFcDNA的真核表达载体pVS121吸附在球囊上，并定位转移至梗塞冠状动脉近心端。转染VEGF基因后心肌血管密度明显增加，有效促进了血管新生。,19,临床试验结果：并不理想,首次：冠脉内和静脉内灌注VEGF165蛋白，在60天的运动耐量、心肌灌注、心绞痛症状或功能分级等方面，治疗组并未获得显著性益处。 FGF血管重建临床试验(FIRST)：一次冠脉内灌注FGF-2，患者功能状况和症状分级显著改善，但90天后运动耐量和心肌灌注与安慰剂相比没有差异VEGF、FGF的一系列双盲、随机的临床研究并没有成功的提出绝对清晰的治疗效果证据，与获临床承认仍有很大的差距。,20,骨髓干祖细胞移植,能促进血管新生并改善心功能，为缺血性心脏病提供了一种新的治疗选择。成人EPC和造血干细胞发生于共同的干细胞，都来源于造血器官骨髓。 用PCR法对人工血管内侧再内皮化细胞的基因进行分析，证实移植的骨髓细胞能参与内皮的形成。,21,胞外基质的研究,在血管新生过程中，内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成不但与促进/拮抗血管生成因子有关，而且也受基质降解蛋白酶和细胞间基质等因素的调节。胞外基质的重建可能产生促或抗血管生成效应。蛋白酶类重塑胞外基质可以促进细胞迁移，这是血管新生的重要事件。 胞外基质分子和胞外基质重塑事件在血管新生调节中扮演了一个关键角色。,22,Miranda D. Grounds, et al. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2002,50(5): 589610,干细胞移植,23,Nature/Vol428/3 April 2004/664-8,145例HSC移植入正常或者损伤的成年小鼠心脏的实验研究，没有发现由干细胞转分化而来的心肌，并且干细胞移植组相对于假移植组心肌细胞数量没有明显的增加，为心肌修复的临床研究提供一个警示。 心脏功能上的改善可能是由于移植对左心室重塑的影响或者是产生了新生血管，而不是心肌再生。过去两年来，开展了一些使用骨髓祖细胞进行心脏修复临床试验。在目前研究中，HSC不能转化形成新的心肌，对这些试验的理论基础提出了质疑。,Problems of HSC,24,Randomized Clinical Trials of Stem Cell Therapy for MI,Circulation. 2006;114:353-358.,25,Is stem cell therapy for cardiac repair ready for patients?,26,作为一项新生事物，干细胞移植可能是治疗缺血性心脏病令人激动的新选择。尤其是那些有大面积心肌梗死患者，因其预后不佳，更有可能从细胞移植治疗中获益。但迄今为止，临床试验结果相互矛盾，仍然处于实验性治疗阶段。,27,促进血管新生 中医药如何？,中医药益气活血、祛瘀生新等许多治疗法则以及临床的有效性，也为中医药血管新生的研究提供了理论和临床依据。,28,血管新生研究的中医药理论基础,“活血生肌”、“袪瘀生新”,创伤愈合不良、溃疡不愈、心肌缺血侧枝代偿不足等。,戴瑞鸿，冠心病心肌缺血的治疗性血管生成与中医药中国中西医结合杂志. 2000,20(3).-163-164,29,麝香保心丸的血管新生研究,30,中西医结合治疗冠心病的特色,“血”“脉”两条途径，整体治疗，体现中医药特色,中西医结合治疗心脑血管疾病,31,32,麝香保心丸的促血管新生作用,对血管生长因子的影响鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验大鼠缺血动物模型临床研究（心肌核素显像)对肿瘤及斑块血管新生的影响对骨髓干细胞的动员对生长因子受体的影响（正在进行）尸检回顾性分析（正在进行）,33,内皮细胞实验麝香保心丸能促进培养的牛肾上腺微血管内皮细胞增殖并形成管腔结构。CAM实验以体外细胞学实验验证CAM实验得出的结论，证实麝香保心丸等的确具有促血管生成活性。,中药促进血管新生作用的证据,34,麝香保心丸的促血管新生作用,促进鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)的血管生成作用,（加有生理盐水的CAM）,（加有麝香保心丸的CAM）,汪珊珊，李勇等。麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用，中国中西医结合杂志2003,23(2),35,增加心肌梗塞大鼠心肌VEGF含量（免疫组化染色）,资料来源:麝香保心丸对实验性心肌梗塞大鼠心脏的促血管生成作用中成药 2002；24（6）：446-449,（生理盐水组）,（麝香保心丸组）,促进缺血心肌血管生长因子表达,36,麝香保心丸促进培养的牛肾上腺微血管内皮细胞管腔结构形成,（ 生理盐水对照组细胞 ）,（麝香保心丸组细胞）,促进培养的内皮细胞形成管腔结构,汪珊珊，李勇等。麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用，中国中西医结合杂志2003,23(2),37,1、2. 小、大剂量麝香保心丸 3. 贝复济与肝素联用组 4. 模型组 5. 假手术组 6 .正常组 7 .卡托普利组,在体研究：大鼠心肌梗死模型梗死边缘区,38,麝香保心丸对内皮祖细胞的影响,A为LSCM激发绿色为结合FITC-UEA-I的EPCs；B为LSCM激发红色的为摄取DiI-Ac-LDL的EPCs；C为LSCM激发呈现橙色为FITC-UEA-I和摄取DiI-Ac-LDL的EPCs（图中均为鉴定的分化祖细胞）,梁春、吴宗贵等，中国中西医结合杂志，June2009,Vol.29,No.6,39,麝香保心丸对分化祖细胞的影响,与对照组比较，麝香保心丸1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml组可以增加EPCs增殖、迁移、粘附、及体外血管形成能力。,40,中药促血管新生作用的可能机制,研究发现麝香保心丸培养的人脐静脉内皮细胞释放 VEGF 和 bFGF 增加，VEGF与bFGF 的 mRNA表达增高。麝香保心丸使血管生长抑制因子的减少。麝香保心丸提高内皮祖细胞（EPCs）迁徙、粘附和血管形成能力。,41,双向调节 对斑块血管新生的抑制,在同一动物双模型（同时有心肌缺血和动脉粥样斑块）发现：麝香保心丸促进缺血心肌血管新生麝香保心丸抑制斑块血管新生,42,对斑块内新生血管的影响,对照组斑块 麝香保心丸组斑块 CD34 免疫组化染色 CD34 免疫组化染色 250倍,CD34抗原是跨膜细胞糖蛋白，主要表达于人或鼠的造血干细胞和血管内皮细胞中，有学者认为CD34为细胞问黏附及信号传导提供了条件，促使内皮细胞分裂 、新生的细胞在CD34的参与下向血管外迁移黏附，构建成新生血管的骨架。,43,斑块内MMP-3阳性面积比较,对照组斑块 麝香保心丸组斑块 MMP-3 免疫组化染色 MMP-3 免疫组化染色 放大250倍,斑块内新生血管情况,44,斑块内的血管新生,研究证实：具有促进治疗性血管新生作用的中成药麝香保心丸，能特异性地抑制斑块内的血管生长，改变斑块内的基质变化，抑制基质降解，从而有利于斑块的稳定。,中国中西医结合杂志 2008.05.28;,45,结 论,临床常用的冠心病治疗药物中，麝香保心丸等有明确的促血管新生作用。中药促血管新生的机理复杂，可能涉及血管生长因子及其受体，以及血管抑制因子等多方面。对同时伴有的心梗范围受限、心室重构的改善和心功能的改善，血管新生可能是参予机理之一。双向调节：抑制斑块内血管新生和基质降解，稳定斑块,46,麝香保心丸的血管新生研究,2002年，发现麝香保心丸对心肌梗塞大鼠的促血管新生2003年，发现麝香保心丸促进CAM血管新生及血管内皮细胞管腔结构形成2004年，麝香保心丸促进血管新生研究结果发表于美国life science杂志2006年，麝香保心丸促进血管新生系列研究荣获中西医结合学会科学技术奖2007年，发现麝香保心丸的双向血管新生调节2008年，发现麝香保心丸对内皮祖细胞的动员作用,47,治疗各种类型的心绞痛Meta分析,48,麝香保心丸治疗后增加心肌灌注,总有效率 70.6%,罗海明，戴瑞鸿等。麝香保心丸改善心肌缺血作用的核心脏影像学研究，中国中西医结合杂志1996,16(6):325-5,心肌影像学实验SPECT,49,10例病人（CAG或OMI），麝香保心丸长期治疗后对心肌灌注/代谢的改善,服药前PET心肌扫描 6月时PET心肌扫描,PET评价麝香保心丸对冠心病心肌血流的影响,50,心肌影像学实验PET,10例受试者共取得180个心肌节段作静息负荷和麝香保心丸治疗前后自身对照分析,相对冠脉血流储备分数治疗前后无显著差异，但治疗后似有可提高相对储备分数的趋势。(P0.077 ),相对血流密度分数,相对血流密度分数,51,临床研究,表11强化治疗组与常规治疗组给药方案,每丸22.5mg，每日含服3次。两组在治疗期间均不得使用其他抗缺血中药。药物由试验药品由上海和黄药业提供，生产批号G040603G060603。,上海市科委基金：中药现代化专项课题04DZ19856资助,52,治疗稳定性心绞痛减少危险事件主要临床事件：心梗、心绞痛住院或急诊、卒中、心衰、心血管原因住院或急诊,53,治疗稳定性心绞痛减少危险事件总临床事件：主要临床事件其他原因住院或急诊,54,长期服用治疗稳定性心绞痛,55,麝香保心丸合并用药情况,200名冠心病稳定性心绞痛患者：硝酸酯类药物在治疗6个月时明显减少。,56,麝香保心丸临床应用小结,有效减少心绞痛发作心肌缺血得到改善与化学药物合用安全,57,减少慢性稳定性心绞痛远期事件的临床研究,上海市科委：中药大品种麝香保心丸的二次开发研究项目编号：09