木聚糖酶的酶活测定.doc

木聚糖酶的酶活测定方法一、 原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的木聚糖酶的活力成正比。酶活定义方法木聚糖酶活力单位是指55、pH5.0的条件下，以每分钟催化木聚糖水解生成1mol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。二、 实验试剂榉木木聚糖（sigma），木聚糖酶（苏柯汉），木糖50mmol NaAC-HAC、DNS试剂、50mmol柠檬酸-Na2HPO4、50mmol甘氨酸-NaOHDNS（1L）配置方法：取3,5-二硝基水杨酸6.3g溶于500ml水中，45水浴溶解后，加2mol/L的NaOH 262ml，不停搅拌，然后加入185g酒石酸钾钠，溶解后加入5g结晶酚（或6.25ml 80%的苯酚），溶解后加入亚硫酸钠5g，搅拌至溶解后冷却定容至1L。4保存，7天后可用，若有絮状物请过滤后使用，有效期为6个月。50mmol NaAC-HAC：称取3.402gNaAC3H2O 溶于蒸馏水中，定容至500ml；用移液器移取1.428ml HAC溶于蒸馏水中，定容至500ml。两者按V（NaAC）：V（HAC）2:1 体积配比，用pH计调节到pH5.0。50mmol柠檬酸-Na2HPO4：称取柠檬酸5.2535gNa2HPO4 4.477g，溶于蒸馏水中定容至250ml；称取柠檬酸5.2535g溶于蒸馏水中定容至500ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。50mmol甘氨酸-NaOH：称取甘氨酸 0.3735g溶于蒸馏水中，定容100ml；称取NaOH 0.200g溶于蒸馏水中，定容100ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。三、 仪器水浴锅、分光光度计、电热套、烧杯、具塞刻度试管、移液器、电子天平四、 标准曲线的绘制1、 木糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水木糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容转移到100ml容量瓶中，再定容至刻度，摇匀，浓度为1mg/ml。2、 按下表制木糖标准曲线表1、木糖标准曲线管号0123456木糖溶液（ml）00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（ml）21.81.61.41.21.00.8加2mlDNS试剂，沸水浴5min，冷水冷却至室温定容至25ml，540nm测吸光度OD540nm以木糖mg数为横坐标，光吸收值OD540nm为纵坐标，绘制标准曲线。五、 酶活测定1、 样品制备榉木木聚糖溶液：准确称取榉木木聚糖，精确到0.001g。50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液用配成1%的榉木木聚糖溶液（最好现用现配，聚糖在酸性条件下易分解）。木聚糖酶：准确称取木聚糖酶，精确到0.001g。用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度，保证吸光度在0.2-0.6之间。2、 DNS法测酶活：取0.9ml 1%的榉木木聚糖溶液于25ml 具塞刻度试管中，加入0.1ml 适当稀释的酶液，于55水浴锅中保温30min后，加1ml蒸馏水，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。混匀测OD540nm。空白用灭活的酶作对照。3、 结果计算木聚糖酶活力（U/g）=rDf1000/150.14/t式中：r：通过OD540nm值从标准曲线上查得与标准木糖溶液相对应的浓度（g/ml）；150.14：木糖的相对分子量，g/mol；t：酶解反应时间，min；Df：稀释倍数：酶活力的计算值要保留三位有效数字。六、 木聚糖酶的最适pH 设置pH梯度3-10，间隔一个单位，来选择木聚糖酶的最适pH，由于榉木木聚糖在柠檬酸-Na2HPO4的溶解度不好，所以按下列方式选择缓冲液：pH 3、7、8 用50mmol柠檬酸-Na2HPO4缓冲液；pH 4、5、6 用50mmol NaAC-HAC 缓冲液；pH 9、10 用50mmol甘氨酸-NaOH。分别用不同pH值的缓冲液配置适量的1%的榉木木聚糖溶液和相应稀释倍数的木聚糖酶液，在最适温度下按酶活测定方法测定，选出最适pH。七、 木聚糖酶的pH稳定性分别用不同pH梯度的缓冲液配置适当稀释浓度的酶液，在最适温度下保温2h，然后在最适温度下按木聚糖酶酶活测定方法测定，选出pH稳定区间。八、 最适温度在最适pH 的条件下，选择一系列温度梯度，分别在30、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100下按酶活测定方法测定酶活，确定最适温度。九、 温度稳定性在最适pH 条件下，将木聚糖酶溶液在一系列温度梯度中保温2h，然后测酶活，确定温度稳定的区间。十、金属离子的影响选用Na+、K+ 、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+ 金属离子和EDTA ，看其是否对木聚糖酶有激活或抑制作用。将上述各物质用最适pH 的缓冲液配成4mmol/L 和12mmol/L，确定金属离子浓度对酶是否有影响。木聚糖酶的分离纯化一、 实验试剂：Trish、HCl、NaCl二、 实验方法（一） 木聚糖酶的分离纯化 1、 上样缓冲液：0.05mol/L的Tris-HCl，PH7.5；梯度洗脱液为含0.1,0.2,0.3, 1.0mol/L 的NaCl梯度的上样缓冲液。2、 将买的木聚糖酶用缓冲液配成1%浓度的溶液。3、 用3倍床体积的上样缓冲液平衡柱子，流速0.5mol/min，上样40ml，洗涤2-3个柱