体外诊断试剂的标准基础

第六章 体外诊断试剂的标准基础,目录,6-1 ISO 17511-2003，即GB/T 2141520086-2 ISO 18153:20036-3 临床化学体外诊断试剂(盒) 通用技术要求6-4 体外诊断试剂性能测试的分析6-5 全自动生化分析仪（YYT 0654-2008）的技术要求,ISO 17511-2003，即GB/T 214152008,该标准规定了对以建立或确认测量正确度为目的的校准品和控制物质赋值的计量学溯源性进行确认的方法。校准品和控制物质由制造商提供，作为体外诊断医疗器械的一部分或与其一起使用。,ISO 17511-2003，即GB/T 214152008,由国际公认的参考测量系统或国际公认的约定参考测量系统赋值的、已证实具有互换性的室间质量评价样品适用于该标准。,6-1 ISO 17511-2003，即GB/T 214152008,GB/T 214152008是关于体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性，由SAC/TC 136全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会提出并归口。,为了使检验医学量的测量得到正确的医学应用、不论在何时何地都具有可比性，量必须有明确的定义，报告给医生或其他卫生人员及患者的结果必须准确（正确和精密）。实现“正确的医学应用”不仅涉及溯源链的计量（分析）内容。测量结果最终由医生为患者服务，因此医生还宜收集许多其他的信息，如关于分析前和分析后问题；诊断灵敏度和诊断特异性，以及有关参考区间等内容。,生物样品中量的测量要隶参考测量系统包括,与测量结果预期医学应用相关的生物样品中分析物的定义；人体样品中选定量的参考测量程序；适用于选定量的参考物质，如一级校准品和具有互换性的二级具基质校准品。,为某一校准品或正确度控制品的一个指定量所赋的值的测量正确度取决于该值通过不同测量程序和测量标准（校准品）的不间断比较链而具有的计量学溯源性。比较链逐级向上测量不确定度不断减小。为一个给定校准品或正确度控制品所赋的值的不确定度则取决于规定的计量学溯源链和与其相关联的合成不确定度。,计量学溯源链的理想终点是国际单位制系统(SI)相关单位的定义，但是，步骤的选择和给定值所处的计量学溯源链的水平，依赖于可以使用的较高等级的溯量程序和校准品。日前在许多情况下，没有比制造商选择的测量程序或制造商的工作校准品更高级的计量学溯源性。此时，在有国际公认的参考测量程序和或校准品可用之前，正确度即指校准级别的水平。,某个被选定的计量学可溯源的校准的目的是将一个参考物质和或参考测量程序的正确度水平传递至一个具有较低计量学水平的程序，例如常规程序。校准的计量学溯源性要求，参考测量程序和常规测量程序测量的是同一可测量，量的分析物具有相同的相关特性。,这里有必要指出，旨在对同一量进行测量相同量的不同的程序用于测量特定某一样品或参考物质时，实际上可能会得出不同的制量结果。例如当用两个或更多的免疫学程序对某个参考物质中的某激素，如促甲状腺索(甲状腺刺激激素，TSH)的浓霞进行测量时就会出现这种情况，因为不同的试剂识别被测物质中的不同抗原决定簇并与其产生不同程度的反应，于是会产生不同的但相互关联的量。,常规通常检验医学可提供400700类量的结果。其中这些量中的大多数，因为仅由（参考）测量程序组成一个计量上的较高步骤、或因测量程序和（参考）校准品组成两个较高步骤等，终止了产品校准品赋值上计量的可追溯性。原因是许多这样的量通常和具有临床上相关性质的分子种类混合物有关，但是，这些比例各异的分子具有不同的结构和相对分子量，如：糖蛋白。根据计量学溯源至SI的可能性及测量程序和校准品的不同计量水平的可获得性。,测量结果可以在计量上溯源至SI的量；有可用的一级参考测量程序和一个或多个（经认定的）一级参考物质（用作校准品）。达到这样水平的有约2530个类型的量，具有较好确定的组分。如：一些电解质、代谢物、甾体激素和一些甲状腺激素。在医学实验室提供的常规结果中，这些量占较大部分。,测量结果不能在计量上溯源至SI的量,有可用的国际约定的参考测量程序（不能称为一级参考测量程序）和一个或多个由此程序赋值的国际约定校准物。如HbAlc(糖化血红蛋白)即是符合该情况的量的组分。有可用的国际约定的参考测量程序，但没有国际约定校准物。符合该情况约有30种类型组分的量，如：凝血因子。有可用的一个或多个国际约定校准物（用作校准品）和赋值方案，但没有国际约定参考测量程序。符合该情况的量约有300多种如使用世界卫生组织(WHO)国际标准的量，如蛋白类激素、某些抗体和肿瘤标记物。既无参考测量程序又无用作校准的参考物质。制造商自行建立“自用”测量程序和校准品，为产品校准品赋值。符合该情况的约有300种组分的量，如抗体和肿瘤标记物等。,GB/T 214152008不适应的范围,没有赋值及只用于评价一个测量程序的精密度，即其重复性或重现性的控制物质（精密度控制物质）；用于实验室内质量控制的控制物质，此类物质具有建议的可接受结果值区间，此区间由不同实验室针对某具体测量程序协议制定，其限值无计量学溯源性；在相同的计量水平下，测量相同量的两个测量程序的测量结果具相关性，但是这样的“水平”相关不提供计量学溯源性；以不同计量水平的两个测量程序结果间的相关作校准，但是测量的量的分析物特性不同；常规结果可溯源至产品校准品的计量溯源性及其与医学判断限值的关系；与名义标度有关的特性，即无量级的特性（例如血细胞分类）。,测量准确度注意事项,测量准确度：根据IS0 5725-1，测量准确度与测量的正确度和精密度有关。（测定的精密度高，测定结果也越接近真实值。但不能绝对认为精密度高，准确度也高，因为系统误差的存在并不影响测定的精密度，相反，如果没有较好的精密度，就很少可能获得较高的准确度。可以说精密度是保证准确度的先决条件。就被测量而言，准确度不能给出一个数字形式的值，只能根据一个明确的目的描述为“足够”或“不足”。从反面衡量准确度的估计是“偏差”，定义为“值减去约定真值”。IS0 3534-1中不使用上述定义中的“真值”的概念，而使用“可接受参考值”，后者可以是理论值（真值）、赋值、公认值或由程序确定的值。,分析物,可测量名称中示出的组分。例：在“24 h尿蛋白量”类型的量中，“蛋白质”是分析物。在“血浆中葡萄糖物质的量”中，“葡萄糖”是分析物。两个例子中的整个短句内容为被测量。分析特异性：测量程摩只测量被测量的能力。,测量值偏倚：测量结果期望值与被测量真值之间的差异。注：一种估计是，“测量的统计抽样偏倚”，等于“平均值减去参考值”。校准：在规定条件下，为确定测量仪器或测量系统所指示的量值，或实物量具或参考物质所代表的量值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。,校准传递方案：使用相同类型量的较高级参考物质，对特定顺序的测量程序进行校准，用于对参考物质进行赋值的过程的详细描述。校准物：具有在校准函数中用作独立变量值的参考物质。有证参考物质，CRM：附有证书的参考物质，其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可朔源到准确复现的表示该特性值的测量单位，每一种出证的特性值都附有给定置信水平的不确定度。,物质的互换性：由两个测量程序测量一给定物质的特定量产生的测量结果间的数学关系，与测量常规样品的量得到的数学关系的一致程度。影响量：非被测量但可影响测量结果的量。国际约定校准物：量值不能溯源至SI，由国际约定予以赋值的校准品。注：该量按照预期临床用途定义。,物质系统的基质,基质matrix：一个物质系统中除分析物之外的所有成分。基质效应：除被测量以外的样品特性，对特定测量程序测定被测量及其测量值的影响。注1：某个基质效应的明确原因即为一个影响量。注2：“基质效应”有时被错误地用于因分析物的变性或加入非真实组分（代用品）以模拟分析物等缺少互换性。,可测量,量：现象、物体或物质可定性区别和定量确定的属性。注1：以一个名义标度表达的特性不是可测量。 注2：不能将“可测量”与“分析物”混淆。被测量：作为测量对象的特定量。 测量程序：进行特定测量时所用的，根据给定的测量方法具体叙述的一组操作。,计量学溯源性,遁过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。注1：通过校准传递方案确定的（参考）测量程序实现每一步比较。注2：溯源性有几种类型。本标准使用术语“计量学溯源性”。,计量学,关于测量的科学。注：计量学涵盖科学或技术的所有领域有关测量的理论与实践的各个方面，包括测量的不确定度。,一级参考物质：具有最高计量特性的参考物质，由一级参考测量程序赋值。 注1：“一级校准品”的概念从属于“校准品”和“一级参考物质”一级参考测量程序：具有最高级计量学特性的参考测量程序，其操作能够被充分描述和理解，可用国际单位制(SI)单位表示完整的不确定度，不必使用测量的量的测量标准为参考，结果即可接受。,注：物质的量咨询委员会使用术语“一级测量方法”，在本标准中，术语“一级参考测量程序”与VIM一致。VIM中不用“决定方法”，但决定方法有时指经充分研究和评价的、具有高准确度的参考测量程序。,参考物质：具有一种或多种足够均匀和很好地确定了酌特性，用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。注：词“均一”指肉眼可见的物质的物理均一性，不是分析物分子间的微观不均一性。,确认validation：通过提供客观证据对特定的预期角途或应用要求已得到满足的认定。验证verification：通过提供客观诞疆对规定要求已得到满足的认定。,如何认识ISO17511,计量学溯源的目的，应是使经校准的常规测量程序所得的结果，按现有校准等级最高水平所得值表示。应在开始进行最终测量前建立计量学溯源链，并以相反方向的降序校准等级，即从计量最高参考到终端用户结果进行描述。,溯源性(可追溯性）,通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。通过一条连续（不间断）的比较链在一定的误差条件下，使病人样品检测结果与国际或国家的参考系统在参考实验室，使用参考方法、参考品得到的结果联系起来的特性。说明结果准确的依据。,实现溯源性的两个基本方式,整个比较链始终以病人的新鲜样品为比对的实验对象。始终以方法学比较为判断结果实现溯源性的实验手段。,现在为什么要求病人样品结果的溯源性？,当前，医学领域对病人疾病的诊断、治疗的监视等，都必须有证据。证据来自各种检查的结果，包括临床检验的结果。所以，临床检验结果必须在以往准确度是相对的水平上，要说明准确可靠的依据。即：准确的依据需要有溯源性（或可追溯性）。为了领会可追溯性。为此，检验结果除了在分析性能（如精密度、正确度、检测范围、分析特异性、分析灵敏度、参考区间等）有足够的证据外；还应显示结果量值在计量单位一致的前提下，和参考方法、或以参考品校准后的方法对病人样品检测结果量相同的依据。这就是追求检验结果的可溯源。,值的溯源性步骤,SI制度、单位的定义,（一）一级标准品（原级参考物）,定义： 是已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经定量。,应用： 用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。,（二）二级标准品（次级参考物）,定义： 这类标准品可以是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），也可以存在于相似基质中。可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。,应用： 主要用于常规方法的标化和控制物的定值。,（三）控制物（质控物）,用二级标准品和常规方法测定，用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。控制物不能用于标定仪器或方法。,定值血清：在发生问题时查找原因,未定值血清：一般情况下使用,另：用二级标准品和常规方法测定，然后定值经过修正后得到校准品。,根据质控品的物理性状不同分为冻干质控品、液体质控品和混合血清等 根据有无测定值可分为定值（蓝色标签）质控品和非定值（红色标签）质控品。 各实验室可根据各自的情况选用以上一种质控品作为室内质控品,质控品的种类,人血清基质，分布均匀。 无传染性。 添加剂和调制物的数量少。 瓶间CV%酶类应小于2%，其它应小于1% 。 冻干品复溶后稳定，28时不少于24小时，20时不少于20天；某些不稳定成分（如BIL，ALP等）在复溶后4小时的变异应小于2% 在实验室的有效期应在一年以上。 合理的成本。,质控品应具有的特征是：,严格按质控品说明书操作。 冻干质控品的复溶要确保溶剂的质量。 冻干质控品复溶的加量要准确一致。 冻干质控品复溶应轻轻摇匀切忌剧烈震摇。 质控品应按规定方法保存不用超期品。 质控品要与标本同样测定条件下测定。,质控品的正确使用和保存,实验方法选择的原则,总原则： 从实际出发，根据实验室的条件和检测要求确定适当的方法。,条件优越的实验室：参考方法,一般临床化学实验室实验室：常规方法或使用方便的参考方法,尽量选用国内外通用方法或推荐方法，便于方法的规范化和质量控制，重点考虑实用性和可靠性。,常规方法选择时的原则：,（一）实用性,微量快速、方法简便、安全可靠、成本低廉,（二）可靠性,所选方法具有较高的精密度、准确度和较大的检测能力，保证测定结果的准确性能满足方法允许误差限度的要求。,标本l、试剂ml,实验方法选择的步骤,（一）广泛查阅文献：,（二）选定侯选方法：全面认识该法。,（三）侯选方法的初步试验：,根据方法选择的要求，比较各种方法,初步试验包括：简单 标准曲线和重复性 质控血清和新鲜标本的重复实验 析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比.,初步试验目的: 使工作者熟悉有关技术,掌握各分析步骤要点,判断能否适合本室条件要求.根据所获得的资料确定是否有必要作进一步研究。,初步试验,为什么将“SI”放在计量溯源性的最高级？,通过对反应条件等的测量系统的描述，它定义被测量、尤其是酶组分等，组成的一级参考测量程序应是给定校准等级的下一水平，但也是第一级操作等级。国际单位制（SI）计量可追溯性链的理想终点是国际单位制（SI）有关单位的定义，但是，步骤的选择和给定值处在计量可追溯性的什么水平上，依赖于可以使用的较高等级的测量程序和校准品。计量可追溯性链的理想终点。注意，检测结果的溯源性一定是结果在数量上的溯源性。这是计量的溯源性。,所有的检测结果都有计量单位。若数量值一样，但是计量不一，结果毫无可比性。更没有任何计量溯源性的基础。为了使检测结果具有溯源性，实现计量单位在全球的一致，这就是国际单位制（SI）的目的。我国于1990年由国务院发布命令，全国实施法定计量单位。国际上，在许多欧美国家，仍然在临床上使用以往的习惯单位。只是在发表的文章中，勉强使用SI。因此，实现全球检测结果的可比性，任重道远。,什么是测量系统或测量程序？,生物样品中量的测量要求参考测量系统，包括：确定生物样品中分析物，以及测量结果的预期临床应用；确定人样品中选定量的参考测量程序；适用于选定量的参考物质，如一级校准品和可以替代的二级具基质校准品。,测量系统检测系统,对样品的检验，必须使用仪器、试剂、校准品、和操作程序组合的检测系统。没有检测系统的固定组合，也就不可能实现样品检验结果的可追溯性。ISO17511的要求是建立在已经具有良好性能的检测系统上，论述检测系统如何实现对样品检验结果的溯源性。因此，单纯的试剂盒没有说明指定在什么仪器上、也没有校准品的，无法证实它对病人样品检验结果的溯源性。单一的仪器，没有说明使用什么试剂盒，也没有指定的校准品，也无法证实任何溯源性。,怎样理解校准品的计量溯源性？,校准品：参考系统与常规检测系统对病人新鲜样品的检测结果，实现了可比性后，如何使常规系统能持续保持溯源性，引入校准品作为实现长期溯源可靠性的“桥梁”。这就是校准品的功效。,校准品,校准品是完成样品检测的检测系统的一个组分。在具有良好性能的检测系统中，校准品的校准值对检测结果的数量起着重要作用。检测系统的要素：（1）试剂；（2）分析仪；（3）校准品。它实现可追溯性中自始至终必需使用新鲜病人样品。始终采用方法学比较，为了使病人样品的结果和参考系统检测结果一致，调整校准品的值。校准品都属于制造商提供的检测系统专用的。从来没有任何系统、试剂通用的校准品。ISO17511中谈及的一级或二级校准品，只是为说清问题，将一级或二级参考品表示为一级或二级校准品。,参考实验室的要素,参考方法；参考品；有资格的人员。通过提取病人新鲜样品，结合具有参考值水平的结果。要求：结果水平公认；因手工操作、要求高；报告速度慢。所以无法适用于常规。,参考实验室,只有在国际认可的参考实验室，使用参考物质或参考方法（程序），对病人样品的检测，得到的结果才有资格被成为参考值结果。未经国际认可的任何实验室，即使使用了参考物质或参考方法，对样品的检测结果不是参考值。,厂商在实现溯源性上的地位重要性,实现溯源性的根本目的是追求病人结果的可靠。实验室只有使用具有溯源性的检测系统，才能使检测结果实现溯源性。因此，厂商在制备产品中，实施质量管理；在此基础上，按照ISO 17511的要求，对校准品的定值实现计量溯源性。对于血清方面的试剂需要注意的是：必须首先建立日常检测系统经具有参考值的病人样品；校准后，它和参考系统在检测病人样品结果上实现了一致性、确认日常检测系统的检测结果在计量上可追溯至参考系统后，才由具有可追溯性的日常检测系统对校准品定值。,根据测量结果计量可追溯至SI的可能性，以及测量程序和参考物质的不同计量水平的可行性，已证实了哪些计量可追溯链的上端参考系统？,参考系统,a) 测量结果可以在计量上可追溯至SI的被测量。有可用的一级参考测量程序和一个或多个（经认证的）一级参考物质（作为校准品）。达到这样水平的有约2530个类型的量，具有良好确定的组分，如：一些电解质、代谢物、甾体激素（可的松）、及一些甲状腺激素等。b) 测量结果不能在计量上可追溯至SI的量。有可用的国际约定的参考测量程序 (不能被称为一级参考测量程序)，和一种或多种用此参考检测测量定值的国际约定校准物质。符合这些条件的量的组分，象HbA1c（糖化血红蛋白）、IFCC酶参考系统。,有可用的国际约定参考测量程序，但是没有国际约定校准物质。符合这些条件的约有30种类型组分的量，如：凝血因子。有可用的一个或多个国际约定校准物质（用作校准品）及定值方案，但是没有国际约定参考程序。符合这些条件的约有300多种量，如：使用世界卫生组织（WHO）国际标准的量，象蛋白激素、某些抗体和肿瘤标志物等，特定蛋白CRM470等。既无参考测量程序，也无校准的参考物质可用。厂商自行建立“自用”测量程序和校准品，为商品校准品定值。符合这些条件的约有300种组分的量，如肿瘤标志物和抗体等。,如何认识控制品的溯源性？,控制品的可追溯性正确度控制物质应满足以下要求实现病人样品结果的溯源性中，临床实验室的责任是什么？,控制品的可追溯性,需要搞清楚标准指的是什么控制品。标准强调了检测系统对病人样品检测结果的可追溯性。为了证实实验室日常使用的检测系统是否仍然处于可追溯性的状态，需要确认。此时，使用被ISO17511标准定义的“正确度控制品（Tureness Control）”，若检测系统对该控制品的检测值，和控制品的值极其一致，则说明：检测系统的可追溯性得到正确地确认。,正确度控制物质（Trueness control material）用于评估测量系统测量偏倚的参考物质。,正确度控制物质应满足以下要求,a) 基质应相似于控制下的测量程序测量的样品；注1 这和要求具有计量上为较高水平的校准品相反，校准品可以是高纯度组分，常处于单一的基质中。b）有定值，其测量不确定度和用途适应。注2原则上，须使用正确度控制物质验证测量真实度；因此，为正确度控制材料定值的传递方案应相似于校准品定值的传递方案。根据正确度控制物质的用途，应使用为相应产品校准品定值时给定等级或更高水平的定值方案。,对于正确度控制品，标准中特别指出，本标准不适用于：1) 没有定值、仅用于评估检测程序的精密度，重复性或重现性的控制物质（精密度控制物质）。2) 用于实验室内部质量控制，附有建议的可接受值区间的控制物质。每个区间由各实验室用某特定测量程序测量协调一致形成每个区间和极值，不具计量溯源性。,对于控制品的可追溯性，国内前阶段有认为，ISO17511讲到控制品定值可以具有可追溯性，所以，定值的控制品都可以有可追溯性，这是严重的误导。要注意：按照ISO要求的定值，要比为校准品定值还严格。一些实验室对控制品的检测结果简单的统计数据，无法属于“正确度控制品”的定值手段。,识别控制品是否属于“正确度控制品”，大致上可以按以下的步骤予以甄别：1）控制品是否是制备检测系统制造商出品的？2）控制品说明书上是否指出：该定值按照ISO17511的规定进行定值？而且，定值只有一个值，以及有不确定度。不是一般控制品定值的均值与标准差、或定值范围。3）控制品是否专用于制造商检测系统，没有其它定值数据？,实现病人样品结果的溯源性中，临床实验室的责任是什么？,临床实验室的责任实验室获得可靠结果，不仅需要具有可追溯性的检测系统；还应重视完成检验的所有过程。在分析前、分析中、和分析后可能出现的任何变异和误差，都要认真实现质量管理。没有这些，再好的检测系统，病人样品无法获得具有可追溯性的结果。建立参考实验室是一个长期的任务。需要基础的积累。国内要通过自己建立参考实验室，确认参考方法与参考物质，如果没有国际的认可，还是难以实现国际量值溯源性。国际上由各国有关学术机构、政府的计量研究院所、制造商的合作，形成了国际检验医学溯源性合作委员会。,6-2 ISO 18153:2003,ISO 18153:2003是关于体外诊断医疗器械生物源性样品中量的测量校准品和控制品中酶催化浓度定值的计量学溯源性的标准，是体外诊断试剂的一个基础性标准。由SAC/TC 136全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会提出并归口。,在体外诊断医疗器械指令98/79/EC中，要求校准品与控制品的定值具有计量学溯源性，能够溯源到上一级参考测量物质和参考测量程序。按照这一概念，关于“溯源性”的标准ISO 17511对测量程序和校准物质的溯源等级进行了具体描述。这一标准中的总则同样适用于催化活性的定量。应当尽可能使计量溯源到SI单位，即校准等级中的最高级。,该标准对酶催化活性浓度（以下称为“催化浓度”）的测量中校准品和测量程序的等级进行了描述。酶学测量中，SI单位定义为 “摩尔每秒立方米（mol/sm3）”，国际计量大会将其命名为“卡特每立方米katal/m3”，是溯源等级的最高级，然后是一级参考测量程序，其它低级测量程序、校准品以及控制品应尽可能溯源至该程序。,测量血液或其他生物体液中酶的催化浓度有助于疾病的诊断。测量底物转化的催化速率分析原理，具有速度快、检测限低、分析特异性高和成本低等优点。只有在同一条件下测量得到的催化浓度值才具有可比性。因此，对一个酶被测量进行说明时，不仅应有量的类（例如催化浓度）、酶和系统的名称，而且还应包括特定的测量程序，特别是测量反应中的指示成份。在溯源等级的顶点，测量程序应是国际认可的，例如“肌酸激酶（CK）的IFCC参考测量程序，以NADH转化速率测量CK”。,因此，一级参考测量程序是被测量的定义不可分割的部分，必须在所有细节处严格遵守，应包括如下内容：底物的种类（由酶的特异性决定）及其浓度、催化剂及其浓度、催化反应的方向、指示成份、缓冲系统及其pH、温度、预温时间、反应启动物质、延迟时间、反应时间。,酶被测量定义对程序的依赖以及造成测量结果的缺陷众所周知：在室间质量评估（EQA）以及评估方法的可转移性出现的问题；生物参考区间的多样性使酶结果的临床应用产生错误的危险。（常规酶测量的标准化对检验医学非常重要，通过消除现有生物参考区间的差异，改善结果的临床应用和可比性。）,可以考虑两种方式：a) 常规只应用每个酶推荐的或标准化测量程序。b) 使用经选定参考测量程序定值的可互换的酶校准品，对一个或多个常规测量程序进行校准。,方法（a）“推荐程序”已经持续追求了20多年。在提高酶测量质量水平和可比性以及废除不好的分析程序方面取得了一定的成就。然而，使用推荐程序进行标准化的途径已经达到了极限。其不足之处在于：在众多推荐程序选择时缺乏一致意见，在常规使用时对推荐程序有意或无意的改动，无意对推荐程序进行分析和技术上的改进，推荐程序对自动化要求相当不适合。常规酶测量程序的改变，不管是否为推荐程序，都不可避免会导致生物参考范围的改变，临床医生必然不易接受。,改进酶测量设计和分析性能将会、也应该永无止境。然而，这一程序需要遵循科学、发展的道理，应具有可操作性。试图通过对标准化测量程序的进一步发展和改进，使其成为“通用”方法的做法既不切实际也不符合需要。,方法（b）“参考测量程序和校准物质” 未得到足够重视，存在的主要问题有：缺乏具有相应基质的稳定酶参考物质作为校准品。候选酶校准品与人样品中的酶存在差异，包括同工酶的差异。酶校准品和含有分析物酶的患者样品，在校准（参考）程序和被校准（常规）程序之间缺乏稳定的程序间比值（即缺乏互换性）。,由这些问题，对建议进行校准的较高等级的酶参考物质和测量程序二者，提出了系列要求。校准品应稳定、内含的分析物酶在其基质中的催化特性应和常规样品中分析物酶的催化特性接近。测量程序自身对目标酶的催化活力具有相同的特异性。对于目标酶的催化活性，测量程序应具有相同的特异性。对于每个临床上重要的酶，可通过选择参考测量程序和证实有关系列程序，实现常规酶测量结果的可比性。只要使用该系列的任何程序得到结果都可以在计量上溯源至选定的参考测量程序。,该标准规定了用于确立或验证酶催化浓度测量真实度的校准品和控制品定值的计量学溯源性的确认方法。该标准适用于由制造商提供的作为体外诊断医疗器械的一部分或者与其组合使用的校准品和控制品。但并不是所有的标准均适用该标准，以下是一些不适用的标准：,参考测量程序设计或选择的要求；包含酶的质量或酶的免疫活性的量；非定值、仅用于评价测量程序精密度，即重复性或重现性的控制物质（精密度控制物质）；用于实验室内质量控制的控制品，此类控制品提供了可接受的数值区间，每个区间都是由不同实验室根据一个规定测量程序得出的，而且该数值区间不具有计量学溯源性；常规结果向产品校准品的计量学溯源性，及其与医学判断限的关系；与名义和顺序标度相关的特性。,定义,物质的互换性：由一组旨在测量同一量的测量程序对某一物质分别进行测量时，各测量结果间可以产生相同的数字关系的能力；以及由同一测量程序测量含有该量的其它相关类型的物质时，可以获得期望的关系的能力,计量学溯源性：通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。注1每一个比较都是通过（参考）测定程序得到的，这些测量程序在校准互换方案中有限定。注2溯源性有几种。故在本文中用了“计量学溯源性”这一术语。,计量学溯源性链与校准溯源等级,ISO17511对生物源性样品中量的测量结果的计量学溯源性及其校准的命名和基本原理进行了说明，它们也可以用于被测物是酶、被测量是衍生量的类“催化活性”（或者进一步的衍生量的类如“催化浓度”或“催化内容”）的情况。一级校准品用一级参考测量程序定值，一级参考物质再用于校准下一级测量程序，以此类推，直到终用户测定常规样品得到的结果。,保证互换方案可用的先决条件,在溯源等级图中的下一级测量程序测量的是同一个量。因此，应表明，校准溯源等级中一级测量程序的二级程序测量的是相同的被测量。例如：特定同工酶的催化浓度或者在给定系统中具有同样相关程度的异构体。,注1：既然量的类“催化活性”定义为在特定反应体系（特定是指：底物浓度、辅助因子、分析部分的体积分数、温度）中，特定底物被转化的速率；高级到低级的所有测量程序的测量条件应尽量相似。应避免任何使校准品或控制品定值不确定度增加的反应条件变化。注2：有些酶的催化特性较缓和，允许对底物的性质加以改变，但是如果在低一级的测量程序中选定的底物与参考测量程序中的底物不同，则需要另外的实验证据表明在修改程序中测量的是相同的量。原则上，如果制造商校准品的定值需要溯源到SI，则需要提供一级参考测量程序和制造商校准品。注1：为降低不确定度，应尽可能多的去除校准溯源中的连续级别对（校准品和程序）。,一级参考测量程序，在给定校准等级中应优于其它水平、处于第一级操作水平的测量程序。描述的内容有反应条件、定义被测量、特别是酶的组分等。测量结果应直接用催化浓度表示，如导出SI单位卡特每升或摩尔每秒升，或是其相应的倍数或约数。测量的每一步应清楚定义，才可能对标准不确定度进行估计。,不确定度,注1：不确定度估计要求清楚描述测量的每一个步骤，实验在控制下，不是自动化的测量程序。注2：一级参考测量程序应由国际公认组织推荐，如国际临床化学和检验医学学会（IFCC）。如果没有国际认可的一级参考测量程序，应当鼓励国家计量机构或科学组织建立这样的程序，以寻求国际认可。注3：IFCC目前正在更新其参考测量程序，允许用摄氏温度370C，代替300C。已经发布了在新的370C下测量ALT，AST，CK，r-GT和LDH的参考测量程序。附录A列出了一级参考测量程序清单。,一级校准品应具有由一级参考测量程序所赋的值和测量不确定度，通过正式的实验室间验证实验，包括互换性的评估。注1：一级校准物质的制备和验证应由国际组织负责。注2：举例来说，BCR有证参考物质是一级校准物质，由欧盟“测量和测试机构”建立。或者由欧盟的“参考物质和测量研究院（IRMM）”与IFCC合作建立。,二级参考测量程序应是由一个或多个一级校准品校准的测量系统。其反应条件应保证被测量与一级参考测量系统相同。应遵循关于说明以及值和不确定度的计算原则。其反应条件应使被测量和一级参考测量系统的是相同的。应使用给出的叙述原则以及值和不确定度的计算。注1：为操作方便，二级参考测量程序应比一级参考测量程序更适合机械操作。注2：二级参考测量程序应由参考实验室或制造商进行说明和实施。,二级校准品应由二级参考测量程序定值。注1：二级校准品可以有证书。注2：可在参考测量实验室或制造商实验室内进行定值。注3：二级校准品可以是具有基质的材料；这些基质相似于最终用户常规测量程序测量的人样品。,制造商选定测量程序应指定一个测量系统，如果可能，该系统应经一个或多个一级或二级校准品校准。注：制造商选定测量程序可以是二级参考测量程序。,制造商工作校准品应由二级参考测量程序定值并确定测量不确定度，也可直接由一级参考测量程序定值。在参考测量程序和被校准的程序间的校准物质应具有足够的互换性。注：制造商工作校准品可以是具有基质的材料；这些基质相似于最终用户常规测量程序测量的人样品。,制造商常设测量程序应由一个或多个制造商工作校准品校准，也可以由计量学上更高级别的校准品进行校准。注：制造商常设测量程序和常规测量程序很接近，但是因输入量和影响量的较小容许区间、以及进行重复测量，可以有较低的测量不确定度。,制造商产品校准品的值和不确定度应由制造商常设测量程序来确定，或者由计量学上更高级的程序来确定。校准物质对于定值测量程序与常规测量程序应具有足够的互换性。最终用户常规测量程序应由一个或多个制造商产品校准品进行校准。制造商应负责证明常规测量程序对常规样品测量的量与一级参考测量程序测量的量相同。,计量学溯源校准的确认,确保真实度传递应是所有相关的测量程序具有相同的分析特异性，并且校准品应具有足够的互换性。,注1：在常规测量程序中（例如体外诊断医疗器械）使用计量学可溯源的校准品的目的是：常规测量程序测量样品得到的被测量结果，与使用的校准品在计量上可追溯到的参考测量程序测量相同样品的测量结果尽可能接近。因此，由校准的常规测量程序给出的值的真实度，来自可用的参考测量程序。注2：依据酶分析物的性质与样品的基质，即使测量系统和两个测量程序间测量步骤的细微差异，也能造成特异性上的差异。,测量程序的分析特异性,按照现有的资料，应完整描述候选测量程序的性质，说明测量程序测量的有可能是相同的量。应表明：垂直校准等级中的所有测量程序，本质上具有相同的分析特异性。应使用典型的最终用户的系列人样品，样品值的范围分布于实际具有的测量区间。为表明两个测量程序在本质上具有相同的分析特异性，两个程序对每个样品得到的值的比例，应在规定实验不确定度的常见的测量区间内是恒定的。注：具有相同分析特异性的所有测量程序，组成了指定量的测量程序组合。,校准品的互换性,制造商工作校准品的互换性可以通过同时用参考测量程序和常规测量程序对制造商工作校准品和一系列相关的人（常规）样品进行测量来评估。对于人样品，如果参考测量程序得到的结果x，和常规程序得到的结果y的数学关系与用两个程序测量制造商校准品得到两个结果的数学关系之间在统计学上没有显著性差异，则证明这个校准品具有互换性。,注1：如果点（x，y）分散在回归线旁，和（或）其偏移量不能被接受，这种现象产生的原因可能是两个测量程序在分析特异性上存在差异。注2：如果人样品的数学关系和工作校准品的数学关系不同，可以通过调整用于工作校准品定值的校正因子或校正函数予以处理差异。应当按用户的需求提供校正因子或校正函数。,制造商产品校准品的有效性，应由参考程序和校准过的常规程序，对本用于常规测量程序测量的一组实际标本进行测量结果的比较予以证明。这些样品应最好来自各个单一供体、未配制混合过的人样品，它们的值应尽可能分布于被测量特定测量区间的整个范围。只有处理过的样品与实际样品相似，才允许配制或混合等处理。,控制品的互换性,如果控制品定值采用的测量程序和常规测量程序不同，应采用和校准物质同样的方法对其互换性进行研究。EU-JRC参考物质和测量研究院（IRMM）可以提供下类物质：制备的酶制品有助于测量血清的酶催化浓度结果的标准化。依据国际临床化学和检验医学学会（IFCC）认可的推荐方法确定每个制品的酶催化浓度。每个CRM用来保证IFCC方法的传递性，并可能为特定方法和IFCC方法得到的结果间建立相关。,6-3 临床化学体外诊断试剂(盒) 通用技术要求,该标准规定了临床化学体外诊断试剂(盒)质量检验的通用技术要求，适用于医学实验室进行临床化学项目定量检验所使用的体外诊断试剂(盒)。该标准不适用于：性能评价试剂（如仅供研究用试剂）；临床化学体外诊断仪器或设备；自测用临床化学体外诊断试剂。,试剂盒,包装在一起并预期用于进行特定体外诊断检验程序的体外诊断医疗器械的一组组件。注：试剂盒组件可包括抗体、酶、缓冲液、稀释液、校准品、控制品及其它物品和材料。,有证参考物质,附有证书的参考物质，其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的表示该特性值的测量单位，每一种出证的特性值都附有给定置信水平的不确定度。注：有些参考物质和有证参考物质，由于不能和确定的化学结构相关联或出于其它原因，其特性不能按严格规定的物理和化学测量方法确定。这类物质包括某些生物物质，世界卫生组织已规定了相应的国际单位。,仪器基本要求,分光光度计或生化分析仪，波长范围覆盖340nm至700nm，生化分析仪应带恒温装置（精度0.1C），吸光度测量精度在0.001以上。净含量：用通用量具测量。,试剂空白测定,用指定空白样品测试试剂（盒），在测试主波长下，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5分钟(T)后的吸光度（A2），A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值；计算出吸光度变化值( )，即为试剂空白吸光度变化率（ A/min）。,线性范围表征,测量精密度测量,批内瓶间差的计算,批间差的计算,准确度的计算,相对偏差比对试验回收试验,相对偏差,用参考物质或有证参考物质(CRM)和相应的参考测量程序按照符合ISO17511规定的溯源顺序对试剂（盒）进行测试，重复测定3次，取测试结果均值（M），按公式B；用由参考方法定值的高、中、低三个浓度的人血清对试剂（盒）进行测试，每个浓度样品重复测定3次，分别取测试结果均值，按公式计算相对偏差。B%(MT)T100%；M为测试结果均值；T为有证参考物质标示值，或各浓度人血清定值。,参照EP9-A2的方法，用不少于40个在测定浓度范围内不同浓度的人血清样品，以制造商指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂（盒）操作方法及比对方法分别测定。用线性回归方法计算两组结果的相关系数（r）及每个浓度点的相对偏差。,在人血清样品中加入一定体积标准溶液（标准溶液体积与血清体积比应不大于1:20或其体积比不会产生基质的变化，加入标准溶液后样品总浓度必须在试剂（盒）测定线性范围内）或纯品，每个浓度重复测定3次，按公式R计算回收率。,稳定性,取在规定的贮存条件下或制造商规定的加速试验条件下保存至有效期末的试剂(盒)测试。,6-4 体外诊断试剂性能测试的分析,线性范围,当需要测定溶液的浓度时，不论溶液的浓度是试剂本身的浓度，还是试剂和样本(如血清、质控品、标准品、校准品)反应的浓度，通常采用浓度和吸光度之间建立标准曲线的方法测定，若证明这种标准曲线是否存在线性关系，做法是根WS/T124临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则关于线性范围的规定把选取的溶液浓度范围取6点包括浓度的下限(或零)、中间值及上限，每点重复测定3次吸光度。根据式(1)、(2)、(3)来计算出直线方程y=a+bx和回归系数：,批间精密度计算,医疗器械制造商通常所采取的批内精密度测试方法是：用1份试剂测定1份样本，连续测定n次，计算结果的均值x0（平均值）和标准差s0，其实这种做法确切的说，是证明了分析仪器测试的稳定性、一致性，并不能证明同一批试剂彼此的差异、离散程度，因此应该用同批号n份试剂分别测定1份样本，计算测定的均值x1（平均值）与标准差s1。其中标准差(s0和s1)的计算公式如式(4)所示：,而真正意义上的标准差应是排除分析仪器仪系统所造成标准差影响的结果，即s批内 ，这样所得变异系数为,该结果更为真实，而且对医疗器械制造商又有利。当然如果忽略分析仪器仪系统所造成标准差的影响，也可以用标准差s1来求变异系数。测试精密度时需注意，从已收集的数据计算出均值和标准差，当任何结果和均值的差值超过4个标准差时，可认为是离群值。在进行这种批内精密度测试时，一次只能有一个离群值，当离群值超过1个时，应怀疑是否为方法不稳定或操作者不熟悉所致。此时，可不用此次测试数据。检查问题和解决问题后重新开始新的测试。,批间精密度,也就是说，这样求出的批间精密度标准差表面上看是2个批次的结果，实际上还是2个批次混合到一批进行计算的结果，并没有明显体现出2个批次之间的差异程度。当然该方法的优点是2个批次均值一样时仍可以体现总体数据中各个数据的差异性，不过缺点是2个批次之间数据差别大时，由于标准差是各个数据与总体数据均值比较而弱化了差异的结果，并没有直接体现2个批次之间显著差异。,批间精密度计算还可以按WS/T124临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则批间精密度的规定进行，即取3个批次的试剂，每个批次3份。分别测定1份样本，分别计算9份试剂测定总均值(xT)和每个批次3份试剂的测定均值(x1、x2、x3)，并按式(7)求出3个批次试剂测定均值的变异系数：,式中：均值xmax为均值x1、x2、x3中的最大值；均值xmin为均值x1、x2、x3中的最小值；xT为总均值。这样求出的批间精密度只是进行了批次之间数据均值的极差计算，并没有标准差的计算，计算过程比较简单。该方法优点是批次之间数据差别大时，可以显著体现批次之间数据结果的差异性，缺点是批次之间均值一样时，则批次之间数据均值的极差没有了差异，因而掩盖了批次之间数据的个体差异。,准确度,按照WS/T124临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则准确度的规定，是用试剂3份平行测定已知浓度的样本。计算测定结果均值，以相对偏差来表示测定结果的不准确度，如式(8)：,式中：(%)为相对偏差，x为样本测定结果的均值T为测定样本靶值。准确度这个指标，是评价试剂有效性的重要依据，在试剂检测的样本浓度范围内都起着准确定量的作用，所以不仅仅局限于某一个浓度的检测。需注意的是x/T可能1，也可能1，可见准确度要求的相对偏差是一个百分比的正负值范围，故相对偏差值不只是一个正的百分数。,灵敏度,灵敏度测定常见的方法有：(1)检测出区别于零值的最低浓度；(2)以不含被测物但其基质与待测定样本相同的空白样本，重复测定20次(剔除3倍标准差的离群值)的均值加2个标准差进行计算。这两种方法都不能准确定量灵敏度，第一种方法只说明了能检测出浓度值，而不能证明检测出的浓度值是否准确，第二种方法的结果实际上检测的是空白本底值，与被检测物无关。,要达到灵敏度准确定量，则试剂所能测定的最低极限浓度，应满足其准确度的要求，也就是说偶尔测试出来的最低极限浓度，并不能说明是否准确，这是没有意义的。当需要对测定最低极限浓度的灵敏度进行精密度评价时，可以把最低极限浓度的样本分成n份，分别和1份试剂反应进行测定，计算出测定最低极限浓度的变异系数，应以20%为宜。,检测范围,试剂检测范围的最低浓度值和灵敏度的结果是一致的，都应满足准确度的要求。同样，试剂检测范围的最高浓度值，不仅是可检测出最高浓度，检测出的最高浓度也应满足其准确度的要求，否则最高浓度是一个区间范围，根本无法确定。,对于定性试剂主要性能是界定阴性和阳性，灵敏度正是界定阴性和阳性的重要指标，因此试剂对样本最低浓度的测定，就决定了定性试剂的主要性能。在定性试剂中，灵敏度是测试最低浓度的指标，准确度是测试阳性结果概率的指标，重复性是测试同一结果的概率，因此检测定性试剂最低浓度呈现阳性结果的概率，就可以验证了定性试剂的灵敏度、准确度和重复性。,6-5 全自动生化分析仪（YYT 0654-2008）的技术要求,全自动生化分析仪是根据光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器；就是将原始手工操作过程中的取样、混匀、温育（37）检测、结果计算、判