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文档简介

第三节原位杂交组织化学标本的制备一 取材用于原位杂交反应的组织应尽可能新鲜 这就要求取材迅速 由于很多RNA极易降解 因此取得的组织应尽可能迅速固定或冷冻 为了避免外援性RNA酶引起靶组织中RNA的丢失 取材时应戴手套 所用的器械 容器都要经高压消毒 或清洁后用经焦碳酸二乙酯 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水清洗 此外 要避免用含RNA酶很丰富的手直接接触组织 器械 容器和溶液等 二 固定在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面 即保持良好的细胞结构 最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平及使探针易于进入细胞 一 固定剂化学固定剂有沉淀固定剂和交联固定剂两类 常用的沉淀固定剂有乙醇和丙酮等 经用沉淀固定剂固定的组织通透性较好 利于探针穿入组织 但沉淀固定剂可能引起RNA的丢失 而且组织的形态结构保存也不十分理想 交联固定剂有多聚甲醛 戊二醛等 醛类交联固定剂可较好地保存组织中的RNA 对组织形态结构的保存也优于沉淀固定剂 但由于戊二醛这样的强交联固定剂固定后的组织通透性很低 探针较难进入其中 一般认为 4 多聚甲醛对检测mRNA的组织固定较为理想 它既能有效地保存靶组织的形态结构 又可使组织具有一定的通透性 二 固定方法先行灌注固定 然后取材并将取下的组织浸入固定液中再行浸渍固定 经固定和漂洗后的组织也可在15 蔗糖磷酸缓冲液中于40C下保存1 2个月 新鲜组织也可以在取材后直接以液氮或干冰速冻 冰冻切片后再浸入4 多聚甲醛固定10 30分钟 干燥后立即进行杂交或保存在 700C冰箱内 如果冰箱温度恒定 可保存数月之久 三 切片在原位杂交中 以冰冻切片最常用 在切片时 要尽量避免RNA酶污染 操作时要戴手套 用70 酒精或10 SDS擦洗工作台 切片机刀架 摇柄和载物台等手常接触的部位以及其它器械 切片厚度可根据具体情况而定 如靶组织中待测mRNA的量较少 所采用的原位杂交技术敏感性较低 为了能得到较多的信号 切片可厚些 约15 20 m 反之 则可薄一些 约5 10 m 如果细胞直接生长在载玻片或盖玻片上 则可将长有细胞的载玻片或盖玻片直接固定 再按上述方法漂洗 干燥 储存 第四节杂交前处理杂交前处理主要包括增强组织的通透性 减低背景染色两个方面 一 增强组织的通透性和核酸探针的通透性增强组织通透性常用去污剂或某些消化酶处理 通过这种处理 可广泛地去除蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透性 常用的去污剂是Triton X100 一般都将切片浸入含0 2 0 5 TritonX 100的PBS内15min 蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十分重要 蛋白酶K还具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用 从而提高杂交信号 二 减低背景染色 一 酸酐和稀酸处理稀酸处理能使碱性蛋白变性 如再结合蛋白酶
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