大肠杆菌的培养与分离

实验1.大肠杆菌的培养与分离,2017/11/18,苍南中学 许允文,2,微生物,病毒细菌放线菌真菌原生生物,原核细胞,真核细胞,非细胞结构,特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.,一、基础知识: 1.微生物的种类:,2017/11/18,苍南中学 许允文,3,关于大肠杆菌:革兰氏染色：代谢类型：主要分布：危害：应用：,革兰氏阴性菌（不着色）,异养兼性厌氧型,肠道,一般无害，少数有害,是基因工程中的主要受体菌之一,2,核糖体,1,阅读P18-19,2017/11/18,苍南中学 许允文,4,2.微生物的培养:,1)培养基的营养成分:2)培养基的种类:,碳源 氮源 水分 无机盐 生长因子,按物理性质分,液体培养基:扩大培养固体培养基:分离、鉴定、纯化,按功能分,普通培养基：选择培养基：筛选鉴别培养基：鉴定,含氨卞青霉素的培养基,伊红美蓝培养基,2017/11/18,苍南中学 许允文,5,3.细菌的分离:原理: 不同的细胞具有不同的菌落特征; 有些微生物对抗生素、高盐等具有抗性的特点。方法: 划线法、涂布法 选择培养基培养,2017/11/18,苍南中学 许允文,6,二、大肠杆菌的培养与分离,实验目的:1、进行大肠杆菌的扩增，利用_培养基进行细菌培养操作。2、进行大肠杆菌的分离，利用_培养基进行细菌的划线培养。3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。,液体,固体,2017/11/18,苍南中学 许允文,7,一、配制培养基，调整pH并灭菌，倒平板备用。,按一定营养比例配制培养基+琼脂，融化调整pH 灭菌 倒平板、搁斜面,细菌:中性偏碱霉菌:中性偏酸,1、放走冷空气；2、灭菌锅压力与大气压相同时才能打开。,2017/11/18,苍南中学 许允文,8,倒平板、搁置斜面,待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。,凝固后，倒置放置,思考：如何鉴定灭菌是否彻底？,放入培养箱中，2d后观察平板是否有菌落生成,2017/11/18,苍南中学 许允文,9,二、接种、扩大培养,1、扩大培养所用的培养基是？2、接种的场所是？3、为何要等接种环冷却后，再取菌体？,2017/11/18,苍南中学 许允文,10,三、划线分离,1、第2、3、4级划线前是否都要对接种环进行灭菌？2、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端？,2017/11/18,苍南中学 许允文,11,2017/11/18,苍南中学 许允文,12,四、培养 将接种后的培养皿放入恒温箱内，在37下倒置培养12-24h。,平板稀释涂布法,平板划线法,2017/11/18,苍南中学 许允文,13,平板划线分离法用途：一般多用于从菌种的纯化；优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；缺点：不能计数稀释涂布平板法 用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。,2017/11/18,苍南中学 许允文,14,五、纯化与保存,1、如何进一步纯化菌种？ 2、如何保存菌种？,2017/11/18,苍南中学 许允文,15,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,2017/11/18,苍南中学 许允文,16,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿壁的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成菌落的细菌随水而扩散，得不到单细胞菌落；防止杂菌污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿壁的培养基上滋生而造成污染，因此最好不要用这个平板培养微生物。,2017/11/18,苍南中学 许允文,17,5.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？6.在培养后如何判断是否有杂菌污染？7.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？,操作快捷,减少操作时间;灭菌要彻底,降低环境污染几率;注意微生物生长条件,如pH、渗透压、温度等。,是否有不同形态的菌落；用显微镜镜检细胞、孢子、芽孢等形态。,高压蒸气灭菌,2017/11/18,苍南中学 许允文,18,8、转基因用的质粒通常加入了如抗氨苄青霉素基因。转基因质粒转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌与不能生长。如何分离转基因工程菌，并保证不被普通的大肠杆菌污染？,将菌种接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。,2017/11/18,苍南中学 许允文,19,1、高压蒸气灭菌2、灼烧灭菌3、紫外线灭菌4、过滤（去除杂菌）思考：灭菌与消毒有何区别？,灭菌的方法：,消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。,灭菌:以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌