实验1大肠杆菌的培养和分离

实验1：大肠杆菌的培养和分离,大肠杆菌（E.coli）,分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、 污水、土壤、谷类、乳制品等当中。,大肠杆菌在人体的_中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入_都会对人体产生危害。大肠杆菌是_工程中被广泛采用的工具。,肠道,泌尿系统,基因,革兰氏_（填阴或阳）性菌,阴,代谢类型：,异养，兼性厌氧型,生长适宜温度：,质粒、,EcoR限制酶、,E.coli-DNA连接酶、,受体细胞,37左右,易培养、生活周期短等特点。,细菌的代谢类型,自养型细菌异养型细菌:,光合自养型:化能自养型:,大部分腐生菌和寄生菌,如蓝细菌,如硝化细菌,1、同化作用类型,2、异化作用类型,需氧型细菌厌氧型细菌兼性厌氧型细菌,大多数细菌,如破伤风杆菌,如酵母菌、大肠杆菌。,大肠杆菌属于异养、兼性厌氧型细菌,大肠杆菌,酵母菌,放线菌,霉菌,菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体。,不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鉴定菌种的重要依据。如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。,菌落的概念,白色或乳白色，光滑,大肠杆菌菌落：,二、 培养基,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,3、调节pH,1、培养基的种类,2、成分,水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子,(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶),真菌：56 细菌：6.5 7.5,4、有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压,(固体、半固体、液体),1.无菌操作的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止_污染的方法。,三、无菌操作,_必须无菌、_也必须要无菌、_时不能带入其他杂菌,主要包括：,杂菌,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。,灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。,各种器具,培养基,转移菌种,高压蒸汽灭菌洒精灯灼烧灭菌干热灭菌,灭菌方法：,煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒法（酒精、氯气等）紫外线消毒法,消毒方法：,3、常用的灭菌和消毒的方法,培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具,需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿,接种环等金属器具,高压蒸汽灭菌锅1kg/cm2 、121下维持15min.,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）,1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克，氯化钠0.5克，水50ml（配固体培养基再加琼脂1克）,溶解,计算称量,调pH,分装,加塞，包扎,2、流程,四 、 操作步骤,灭菌,倒平板,分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用_。加塞：试管用塑料盖或_；三角瓶口用_或_封口,再用_或报纸封口。包扎：用_或报纸,三角漏斗,棉花塞,封口膜,6层纱布,牛皮纸,牛皮纸,高压蒸气灭菌法,灭菌,1）加水：,2）装锅：,向外层锅内加入适量的水，加水的要求是_.,物品放置的要求_：,加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_内。再以_方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。,不触及内胆,整齐、稳定、留出空隙,排气槽,两两对称,3）加热排气：,4）保温保压：,5）出锅：,打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的_。_后，关上排气阀。,当锅内压力升到_kg/cm2时，控制热源，维持压力至_min。,切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_时，打开_，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。,冷空气,待冷空气完全排尽,0,1,15,排气阀,否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。,灭菌后，通常将实验用具放入6080 _中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_。,烘箱,污染,倒平板：待培养基冷却至_ 时，将每只培养皿倒入_ml未凝固的固体培养基，置于_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。_备用。制斜面：将未凝固的固体培养基的试管_放，冷却待凝使即成为斜面。,1012,水平,倒置,斜,倒平板、制斜面操作平台：,灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_和_，灭菌30min.,过滤风,紫外线,超净台,超净工作台,紫外灯过滤风,思考题：一、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。,二、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,思考题,三、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。 四、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,五、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。,（二）液体培养基接种培养,主要器具：,操作方法：先将接种环进行_灭菌, _后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于_摇床振荡培养小时。,无菌操作：略,摇床,思考：如何冷却接种环？可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的目的。,接种环、摇床等,灼烧,冷却,分离细菌的方法：,划线分离法,涂布分离法,（三）划线分离法,主要器具：,操作过程：,注意：,无菌操作方法：同前。,将培养皿_（盖在下），放于_恒温培养箱中培养_小时。,在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始_划线。,接种环、,思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总共进行几次灼烧灭菌？,恒温培养箱。,每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。,末端,倒置,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。,2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。,（四）涂布分离法,主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管,操作过程：,先将培养菌液稀释（10-510-7倍）,用移液管或吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上。在适当稀释度下，可培养得到相互分开的的菌落。将培养皿倒置（盖在下），放于 恒温培养箱中培养小时。,划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，但操作复杂些。,（五）斜面接种及菌种保存,主要器具：,操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在_上， _恒温培养箱中培养_小时后，_ 冰箱保存。,无菌操作：同前,试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。,思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？,接种环、恒温箱、冰箱,单,斜面,思考题？,利用培养基技术不仅可以分离微生物，也可以进行植物组织培养。请简要说明这两项技术应用设计思路的相同点以及区别。,相同点：都是从培养对象所需的营养条