绿脓杆菌终结

化妆品中铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的检测,概述,随着人们生活水平提高，化妆品成为美化人民生活的必需品。然而化妆品的生产流程以及适宜微生物生长的一些生境特征，如含有水分，蛋白质，氨基酸，pH等，均易造成化妆品的污染。某些病原微生物的污染可对人体健康造成危害，同时微生物污染会影响化妆品的质量，因此对化妆品进行微生物检验具有十分重要的意义。,我国化妆品卫生规范对化妆品的微生物学质量规定如下：,1.眼部化妆品及口唇等黏膜用化妆品以及婴儿、儿童用化妆品菌落总量500cfu/ml(g)2.其他化妆品菌落总数1000cfu/ml(g)3.每克或者每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌4.霉菌和酵母菌总数1000cfu/ml(g),铜绿假单胞菌具有十分重要的卫生学意义： 其在自然界分布甚广，空气、水和土壤中均存在，对外界抵抗力较其他细菌强，适宜在潮湿环境中生长，水分含量较多的化妆品易受其污染。该菌为条件致病菌，能引起人眼、耳、鼻、喉、皮肤的化脓性感染特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。因此，对化妆品中铜绿假单胞菌的检验非常有必要。,铜绿假单胞菌生物学特性,1.形态染色 革兰氏阴性杆菌，有荚膜，单端有1到3根鞭毛2.培养特征 需氧及兼性厌氧的，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径2mm3mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。在42条件下可以生长，可与类似菌区别。3.氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气。,本次实验检测方法采用GB 7918. 487 化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌。2007年1月1日开始执行的化妆品卫生规范也有介绍。,实验目的,1.掌握化妆品中微生物检测的意义。2.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。3.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程及几种培养基的配置方法。,实验原理,铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶还原硝酸盐为亚硝酸盐产生氮气，421条件下能生长。,检测流程,化妆品的前处理 接样于营养肉汤增菌，37，12h，140rpm培养分离培养，挑取培养物接于十六烷基三甲基溴化铵平 板， 37，18-24h 染色镜检,生化试验,配十六烷基三甲基溴化铵培养基（选择性培养基，大肠杆菌不能生长，革兰氏阳性菌生长完全受到抑制） 配绿脓菌素测定用培养基，明胶培养基，硝酸盐蛋白胨水培养基，普通琼脂培养基,特征性检验氧化酶 绿脓菌素 硝酸盐还原 明胶液化 42 生长 试验 试验 产气试验 试验 试验取菌+ 1滴 接菌，37 接菌 接菌 接菌二甲基对 24h +氯仿 37 24h 37 24h 42 24h 苯二胺 移出+盐酸紫红色（+） 紫红色（+） 有气体（+） 溶解成液状（+） 生长（+） 不变色（-） 不变色（-） 无气体（-） 未溶解（-） 不生长（-）,样品采集,所采集的样品应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10ml。包装量小的样品，取样可以酌减。,样品前处理及注意事项,1.亲水性样品（水包油型） 可直接用灭菌生理盐水稀释。取10ml或10g样品加到90ml生理盐水中，制成1:10的稀释液。2.疏水性样品（油包水型） 先在样品中加入液体石蜡混匀，再加吐温80使之均质化，最后加灭菌生理盐水稀释。制成1:10的稀释液。3.要中和化妆品中防腐剂的抑菌作用，培养基要提供高营养的成分。,第一部分实验：分离培养,从增菌培养液中挑取培养物，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置37培养1824h，进行分离培养。,第二部分实验染色镜检及五项指标试验,一、革兰氏染色实验 选择可疑菌落，革兰染色，在油镜下观察细菌的形态以及菌体的颜色。,铜绿假单胞菌镜下形态图示：,若镜检为革兰染色阴性杆菌者则进行氧化酶实验,二、氧化酶试验,原理：有氧呼吸过程中，氧化酶（oxidase）在电子传送系统扮演重要角色，其可藉氧分子将已还原的细胞色素（reducedcytochrome）氧化，产生水或过氧化氢。好氧菌与部份兼性厌氧菌及微好氧菌均具氧化酶的作用，本实验有助于区分奈瑟氏菌属（Neisseria）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）与肠道杆菌科（Enterobacteriaceae）前两者为氧化酶阳性(oxidasepositive)，而后者为氧化酶阴性（oxidasenegative）。方法： 取菌于白色滤纸片+1滴1%二甲基对苯二胺 1530s 变红色（+） 不变色（-） 若为（+）则进一步进行绿脓菌素实验,三、绿脓菌素实验：,方法：23个可疑菌落绿脓菌素培养基37 24h 35mL氯仿振荡 提取液呈蓝色取液体于一新试管+1mL1mol/L盐酸 结果判断： 上层盐酸内变为红色为（+），不变色则为（-）。 若为（-）则仍需进行以下三个实验排除,四、硝酸盐还原产气实验,方法： 可疑菌落硝酸盐蛋白胨水 37 24h 小倒管内有气体产生为（+），否则（-）。 五、明胶液化实验方法： 可疑菌落穿刺接种于明胶培养基 37 24h 取出放冰箱1030min，明胶呈溶解状为（+），不溶解则为（-）。,六、42生长实验,方法：挑取可疑菌落普通琼脂斜面42 24h铜绿假单胞菌生长，