凋亡相关蛋白和肿瘤分子靶向治疗的研究进展.doc

凋亡相关蛋白和肿瘤分子靶向治疗的研究进展摘要 随着分子生物学的不断发展，人们对肿瘤发生、发展机制的研究也越来越深入。近年来肿瘤的分子靶向治疗已成为当今肿瘤治疗研究的热点。本文介绍近几年来国内外发现的凋亡相关蛋白及调控凋亡相关蛋白的一些特异性蛋白质对细胞凋亡的作用，促进或抑制肿瘤细胞增殖的可能的分子机制，有望成为肿瘤分子靶向治疗的新的靶点，从而为肿瘤的分子靶向治疗及抗肿瘤药物的研发开辟新的前景。 全世界每年约有700万人死于恶性肿瘤，目前肿瘤的发病率和死亡率都呈现逐渐上升的趋势。放疗、化疗等传统的肿瘤治疗方法不仅杀死肿瘤细胞，而且对人体正常的细胞也有很大的杀伤力，明显地降低了人体的免疫力，造成感染、骨髓造血抑制等一系列严重并发症和药物毒副作用。随着分子生物学的不断发展，人们对肿瘤发生、发展机制的研究也越来越深入。近年来人们提出了肿瘤的分子靶向治疗，在肿瘤治疗中具有广泛的前景，相对于放疗、化疗等传统的肿瘤治疗手段，分子靶向治疗具有特异性强、疗效高、用药量低、毒副作用小、人体耐受性好等优点。肿瘤分子靶向治疗的关键是诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡的信号转导通路包括内源性通路、外源性通路和内质网应激通路这三大通路，共同的终末通路是caspase激活启动细胞凋亡进程。内源性通路又称为线粒体途径，外源性通路又称死亡受体途径，包括：Fas/Fasl途径、TNF途径和TRAIL途径。细胞凋亡要受到生物体自身的严格控制，目前重要的凋亡调控蛋白包括Bcl-2家族蛋白、P-53蛋白和IAP家族蛋白。在细胞凋亡信号传导通路上的凋亡相关蛋白如果发生甲基化、磷酸化、突变等异常，导致了凋亡相关蛋白的失活，从而抑制了细胞的凋亡。细胞凋亡以及凋亡蛋白的调控与肿瘤的发生密切相关，因而成为肿瘤分子靶向治疗的靶点。本文主要就近几年来国内外发现的一些特异性蛋白质如何引起细胞异常增殖，导致肿瘤的发生做一介绍。1 FAP-1蛋白与Fas/Fasl途径Fas系统是介导细胞凋亡的信号转导系统，主要由Fas配体（Fasl）及其相应的受体（Fas-R）构成。Fas又称CD95或凋亡蛋白-1（Apo-1），是一种细胞膜型糖蛋白，分子量为43KDa,属于肿瘤坏死因子受体家族（TNFR），胞膜外区有3个富含半胱氨酸的结构域（CRD），胞浆部分含有70个左右DD（death domain）区。Fasl（Fas配体）为细胞膜型糖蛋白，分子量为40KDa。Fas先与其配体Fasl结合，然后通过DD区与FADD（Fas相关死亡蛋白结构域）结合，形成死亡诱导信号复合物（death inducing signaling complex, DISC），再通过FADD的DED（death effector domain）区，将procaspase-8募集在DISC上，通过激活的caspase-8直接活化caspase-3,从而导致细胞的凋亡。Caspase（cysteine-containing aspartate-specific proteases）是指一群含有半胱氨酸的蛋白酶，目前发现有14种caspase家族成员，根据在细胞凋亡中的作用，caspase分为两大类，一类是启动caspase，包括caspase-2,-8,-9,-10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的凋亡过程。另一类是效应caspase,包括caspase-3,-6,-7等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者,完成对特定蛋白质底物的水解。其中caspase-3是最重要的成员，引起细胞凋亡的最下游成分，是细胞凋亡的效应分子。Caspase引起细胞凋亡的途径通常为死亡受体接受死亡信号，引起上游procaspase-8的激活，导致procaspase-9激活，最终导致caspase-3的激活，caspase-3对特定蛋白质底物进行水解，破坏细胞核纤层，直接导致细胞结构的破坏，使细胞凋亡。FAP-1（Fas相关磷酸酯酶）是已发现的一种蛋白质酪氨酸磷酸酯酶，其功能与Fas系统之间有着密切的联系。据研究发现FAP-1可以与Fas分子在胞质尾部的15个氨基酸残基结合，即与Fas C端负性调节区相结合，而抑制Fas的活性，使Fas不能与Fasl结合，阻断凋亡信号的传递。在正常组织中FAP-1不表达或低表达，而在肿瘤中FAP-1蛋白表达增高，消除了Fas介导的凋亡，所以FAP-1是Fas介导凋亡途径中的一个负性调节蛋白，可成为肿瘤分子靶向治疗的靶点。2 TRAIL 蛋白肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）又称凋亡蛋白2配体（Apo-2 Ligand），为型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族成员，TRAIL C端（胞外区）有一与Fasl和INF-同源三聚体亚单位结构，与受体结合而发挥生物学效应。TRAIL受体主要包括DR4和DR5这两种死亡受体，DR4和DR5均含有胞内死亡结构域和依赖caspase途径凋亡信号的识别结构域。死亡受体DR4或DR5通过其胞外区与TRAIL结合后，富含半胱氨酸的胞外区能结合Fas相关死亡蛋白结构域（FADD），FADD含有与胱冬酶原（procaspase）分子相似的死亡效应蛋白结构域（DED），再与procaspase-8串联结合，形成“TRAIL-DR4/DR5-FADD-procaspase-8”的大分子复合体，即死亡诱导信号复合体（DISC），可使caspase-8激活,再通过启动非线粒体依赖性和线粒体依赖性这两种细胞凋亡途径，导致细胞的凋亡。非线粒体依赖性途径：caspase-8活化后能够引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase蛋白酶）的级联反应，并进一步链式水解激活其下游的同源酶，直至最终激活caspase-3从而导致细胞的凋亡。线粒体依赖性途径：激活的caspase-8切割胞质中Bcl-2家族成员BID产生tBID，tBID转位到线粒体，导致线粒体跨膜电位崩解，使线粒体膜通透性增加，释放出细胞色素C（Cytc），Cytc与Apaf-1（凋亡酶激活因子-1）结合后，再与procaspase-9结合，形成凋亡复合体，活化caspase-9激活下游caspase-3，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。这两条通路汇合于caspase-3，再由caspase-3催化诸多与凋亡形成有关的靶分子降解，最终导致细胞凋亡。TRAIL能选择性与细胞表面死亡受体结合，诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞无明显的毒性反应。体外实验发现携带TRAIL基因的腺病毒转染的肿瘤细胞不但可以诱导其自身肿瘤细胞的凋亡，还可以通过旁路效应诱导未转染的肿瘤细胞的凋亡，因而认为使用TRAIL促进剂可提高TRAIL的表达水平，有效阻止肿瘤发生、发展进程，为肿瘤的分子靶向治疗提供新的靶点。3 Survivin蛋白与IAP家族蛋白IAP（inhibitor of apoptosis protein）为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质因子，所有的IAP都含有对抗凋亡作用非常重要的70氨基酸的BIR重复序列（Baculovirus IAP Repeat）。在C末端还拥有一个高度保守的RING序列，因而它们具有泛素（Ubiquitin）E3的活性。IAP抗凋亡的机制：通过BIR序列与caspase蛋白质作用，可以直接抑制caspase-3，caspase-7和caspase-9的作用；通过RING序列，IAP可以催化caspase-3和caspase-7泛素化，导致这些caspase被procaspase降解，从而抑制细胞的凋亡。Survivin蛋白是新发现的一种凋亡抑制蛋白，为细胞凋亡抑制蛋白IAP家族的一个新成员。Survivin BIR功能区通过与有丝分裂的微管结合，能够特异性作用于凋亡过程中的caspase，主要抑制caspase-3，caspase-7的活性，从而阻断细胞的凋亡过程。另外，Survivin也可通过P21间接抑制caspase，其机制是Survivin与细胞周期调控因子CDK4形成Survivin/ CDK4复合体，使得P21从CDK4的复合体中释放出来，P21进一步与线粒体caspase-3结合，抑制其活性，从而阻止细胞凋亡。Survivin在前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌等肿瘤中表达增强，如果有效地抑制或失活Survivin，可成为肿瘤分子靶向治疗的靶点。4 Livin蛋白Livin是新近发现的一个凋亡蛋白抑制因子。它包含有一个高度保守杆状病毒IAP氨基酸重复序列（BIR）和一个锌指状结构域，其中BIR是Livin与caspase互相作用并抑制其活性的必要成分。Livin抑制细胞凋亡作用主要通过其BIR区与凋亡的核心物质caspase结合，直接作用于caspase-3和caspase-7，从而抑制其活性，阻止细胞的凋亡，也可直接抑制procaspase-9的活化过程或直接抑制活化的caspase-9的功能从而发挥抗凋亡作用。Livin在多数正常组织中不表达，而在前列腺癌、结肠癌等肿瘤组织中特异性高表达，有效地抑制或失活Livin,可成为诱导肿瘤凋亡分子靶向治疗的新靶点。5 ABT-263和Bcl-2家族蛋白 Bcl-2家族蛋白是另一组抑制细胞凋亡的蛋白质，参与细胞凋亡的调控。Bcl-2家族蛋白成员Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1及其所编码的蛋白能抑制细胞凋亡并能在生长因子缺乏时延长细胞存活时间，甚至使细胞“永生化”，因而与肿瘤的发生发展密切相关。抗凋亡蛋白分子Bcl-2和Bcl-xl的过度表达在对凋亡刺激反应中阻止细胞色素C（Cytc）的释放，使Cytc不能与procaspase-9结合形成凋亡复合体，无法激活下游caspase-3从而抑制肿瘤细胞的凋亡，因此Bcl-2家族蛋白在调控凋亡的线粒体内源性途径中起了关键性的作用。 ABT-263蛋白是新近发现的一个潜在的口服的和可利用的Bcl-2家族蛋白抑制因子。ABT-263对Bcl-2、Bcl-xl、和Bcl-w具有很高的亲和力，能破坏Bcl-2/ Bcl-xl与死亡蛋白的相互作用，导致凋亡的启动。在人类肿瘤细胞中，ABT-263导致Bax易位、细胞色素C（Cytc）的释放，从而促进肿瘤细胞的凋亡。据报道ABT-263在小细胞肺癌和急性原始淋巴细胞白血病的异种移植模型中能导致全部肿瘤的退化，在B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的异种移植模型中能大大增强常规化疗的疗效。因此可以为肿瘤的分子靶向治疗提供新的靶点。6 热休克蛋白60与线粒体凋亡途径 线粒体是多种应激因素诱导细胞凋亡的主要通路之一，线粒体凋亡通路的启动始于线粒体释放促凋亡因子进入胞浆，这些因子包括细胞色素C、凋亡诱导因子、核酸内切酶G等，其中细胞色素C是一个主要因子。线粒体凋亡通路主要受Bcl-2家族蛋白的调控。 热休克蛋白（heat shock protein, HSP）是可被热休克诱导表达的一类结构高度保守的蛋白，是维持细胞生命活动所必需的蛋白质。根据分子量不同，HSPs分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和sm HSP（small HSP）等多个家族。真核生物的HSP60主要位于线粒体内（大约7080%），是线粒体内最主要的分子伴侣蛋白之一，能帮助线粒体基质蛋白正确地折叠及调节细胞信息传递通路。高表达HSP60可显著抑制胞内淀粉样肽聚集所诱发的线粒体释放细胞色素C（Cytc），使细胞色素C（Cytc）不能进入胞浆与凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）相互作用激活procaspase-9，从而无法启动caspase的级联反应，阻断caspase-3的激活，最终抑制细胞的凋亡。HSP60过表达还可增加抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的含量，减少促凋亡因子Bax和Bad的含量，从而稳定线粒体膜电位，阻止细胞色素C（Cytc）的释放，最终抑制caspase-3的激活，阻断细胞凋亡过程。因此选择性抑制肿瘤细胞HSP60过表达，就可导致肿瘤细胞的凋亡，从而为肿瘤的分子靶向治疗提供靶点。 总之，肿瘤的发生是一个多基因参与的多步骤的复杂过程，肿瘤的发生与细胞凋亡相关蛋白抑制及细胞凋亡相关蛋白调控异常密切相关。肿瘤的分子靶向治疗已成为当今抗肿瘤治疗研究的热点。上述介绍了近几年来发现的凋亡相关蛋白及调控凋亡相关蛋白的一些特异性蛋白质。通过它们对细胞凋亡的作用，为肿瘤的分子靶向治疗提供新的靶点，从而为肿瘤的分子靶向治疗及抗肿瘤药物的研发开辟更广阔的前景，有望在肿瘤的病因学、预防、早期诊断、合理治疗、生命质量等方面实现突破。 参考文献1 Christin Tse, Alexander R. Shoemaker, Jessica Adickes, et al . ABT-263: A Potent and Orally Bioavailable Bcl-2 Family Inhibitor. Cancer Res 2008;68(9):3421-8.2 Stefanie Galbn,* Clara Hwang, Julie M. Rumble, et al. CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF IAPS REVEALED BY A SMALL MOLECULE ANTAGONIST. Biochem J. 2009; 417(3): 765-771.3. Feng-Ting Liu1, Samir G. Agrawal1, John G. Gribben2, et al. Bortezomib blocks Bax degradation in malignant B cells treatment with TRAIL. Blood 2008; 111(5): 2797-2805.4. Mijin Kim1, Jessica Liao1, Melissa L. Dowling1, et al. TRAIL Inactivates the Mitotic chec-kpoint and Potentiates Death Induced by Microtubule-Targeting Agents in Human Cancer cells. Cancer Res 2008;68(9):3440-9. 5. Jinrong Cheng, Bonnie L. Hylander, Maria R.Bear, et al. Multiple mechanisms underlie resistence of leukemia cells to Apo2 Ligand/TRAIL. Mol Cancer Ther 2006;5(7):1844-53.6. Anja Troeger, Meinolf Siepermann, Gabriele Escherich, et al. Survivin and its prognosticSignificance in pediatric acute B-cell precursor lymphoblastic leukemia. Haematologica 2007;92(8): 1043-1050. 7. Domagoj Vucic, Wayne J. Fairbrother. The Inhibitor of Proteins as Therapeutic Targets in Canc-cer. Clin Cancer Res 2007; 13(20): 5995-6007.8. Mads Hald Andersen, Inge Marie Svane, Jurgen C. Becker, et al. The Universal Character of theTumor-Associated Antigen Survivin. Clin Cancer Res 2007; 13 (20): 5991-6001.9. Edward Laane, Theocharis Panaretakis, Katja Pokrovskaja, et al. Dexamethasone-induced apop -tosis in acute lymphoblastic leukemia involves differential regulation of Bcl-2 family members . Haematologica 2007; 92 (11): 1460-1469.10. Katja Janssen, Stephan Pohlmann, Reiner U. Janicke, et al. Apaf-1 and caspase-9 deficiency pr -events apoptosis in a Bax-controlled pathway and promotes clonogenic survival during paclit -axel treatment. Blood 2007; 110 (10): 3662-3672.11. Kian Behbakht, Lubna Qamar, Carrie S. Aldridge, et al. Sixl Ovarian Carcinoma Causes Resis -tance to TRAIL-Mediated Apoptosis and Is Associated with Poor Survival. Cancer Res 2007; 67 (7): 3036-42.12. Katherine D. Crew, Marilie D. Gammon, Mary Beth Terry, et al. Genetic Polymorphisms in th -e apoptosis-associated genes FAS and FASL and breast cancer risk. Carcinogenesis 2007; 28 (12): 2548-2551.13. Kyung-jin Park, Seung-Hyun Lee, Tae-In Kim, et al. A Human scFv Antibody against TRAIL Receptor 2 Induces Autophagic Cell Death in Both TRAIL-Sensitive and TRAIL-Resistant Ca -ncer Cell. Cancer Res 2007; 67 (15): 7327-34.14. Marzia Pennati, Marco Folini and Nadia Zaffaroni. Targeting surviving in cancer therapy: fulf -illed promises and open questions. Carcinogenesis 2007; 28 (6): 1133-1139.15. Fengzhi Li and Michael G. Brattain. Role of the Survivin Gene in Pathophysiology. Pathology 2006; 169 (1): 1-22.16. TO Garnett, M Filippova, and P J Duerksen-Hughes. Accelerated degradation of FADD and p -rocaspase 8 in cells expressing human papilloma virus 16 E6 impairs TRAIL-mediated apopt -osis. Cell Death Differ 2006; 13 (11): 1915-1926.17. Tateki Yoshino, Hiroaki Shiina, Shinji Urakami, et al. Bcl-2 Expression as a Predictive Marker Of Hormone-Refractory Prostate Cancer Treated with Taxane-Based Chemotherapy. Clin Canc -er Res 2006; 12: 6116-6124.18. Hongbo Hu, Cheng Jiang, Todd Schuster, et al. Inorganic selenium sensitizes prostate cancer c -ells to TRAIL-induced apoptosis through superoxide/p53/Bax-mediated activation of mitocho -ndrial pathway. Mol Cancer Ther 2006; 5 (7): 1873-82.19. Yanyan Yan, Xiaodong Su, Yongju Liang, et al. Emodin azide methyl anthraquinone derivative Triggers mitochondrial-dependent cell apoptosis involving in caspase-8-mediated Bid cleavag -e. Mol Cancer Ther 2008; 7 (6): 168