蛋白质化学1

第一章 蛋白质化学,一.蛋白质的生物学意义 二.蛋白质的元素组成 三.蛋白质的氨基酸组成 四. 肽 五. 蛋白质的结构 六.蛋白质分子结构与功能的关系 七.蛋白质的性质 八.蛋白质的分离与分析技术 九.氨基酸序列的测定 十.蛋白质分类,蛋白质的生物学意义,蛋白质 (protein):是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。,一.蛋白质的生物学意义,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本结构和功能的物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与几乎所有的生命活动过程。,1.作为生物催化剂；酶2.调节新陈代谢反应；胰岛素(激素)3.运输载体；血红蛋白、细胞色素C 4.参与机体的运动；肌动蛋白与肌球蛋白5.参与机体的防御；抗体,免疫球蛋白6.接受传递信息；视色素、受体蛋白、味觉蛋白7.调节或控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达； 阻遏蛋白,1.元素组成： 碳 50-55% 氢 6.5-7.3 氧 19-24 氮 16% 硫 0-3 其他 微量（P Fe Zn Cu I Mo等）,二.蛋白质的元素组成,2.蛋白质的含氮量,大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。 蛋白质含量=蛋白氮 6.25 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）,氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸（standard amino acids)组成。180天然氨基酸包括蛋白质氨基酸,稀有氨基酸(Hyp,Hyly,Cys)和非蛋白质氨基酸(Orn,Cit).,三.蛋白质的氨基酸组成,（一）蛋白质的水解,蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解。,1、酸水解,6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解约20小时。优点：不容易引起水解产物的消旋化，得到的是L-氨基酸。缺点：色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成羧基。,2、碱水解,5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。优点：色氨酸在水解中不受破坏。缺点：由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化，其产物是D-型和L-型氨基酸的混合物。,3、酶水解,酶水解不破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 蛋白水解酶(proteolytic enzyme) 已有十多种常见的有：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。,-氨基酸：,不变部分,可变部分,蛋白质的氨基酸组成,（二）氨基酸的结构通式,1、旋光性:(除Gly)在旋光计上能使偏振光平面向左或向右旋转.右旋(+)、左旋(-)2、立体异构体:每一种氨基酸都有D或L型立体异构体.,L氨基酸,D氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的结构通式,1、根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、Lys、Arg（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类,（三）氨基酸的分类,脂肪族氨基酸,氨基乙酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,甘氨酸 Glycine,-氨基丙酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,丙氨酸 Alanine,甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,-氨基异戊酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,丙氨酸 Alanine,甘氨酸 Glycine,缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸,-氨基异己酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,丙氨酸 Alanine,甘氨酸 Glycine,缬氨酸 Valine,亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸,-氨基-甲基戊酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,丙氨酸 Alanine,甘氨酸 Glycine,缬氨酸 Valine,亮氨酸 Leucine,异亮氨酸 lleucine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,含硫氨基酸, -氨基-巯基丙酸,半胱氨酸 Cysteine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,甲硫氨酸 Methionine, -氨基-甲硫基丁酸,半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,含羟基氨基酸, -氨基-羟基丙酸,丝氨酸 Serine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,含羟基氨基酸, -氨基-羟基丁酸,苏氨酸 Threonine,丝氨酸 Serine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,酸性氨基酸, -氨基丁二酸,天冬氨酸 Aspartate,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,含酰胺氨基酸,2-氨基3-酰胺基丙酸,天冬氨酸 Aspartate,天冬酰胺 Asparagine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,天冬氨酸 Aspartate,天冬酰胺 Asparagine,酸性氨基酸, -氨基戊二酸,谷氨酸 Glutamate,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,天冬氨酸 Aspartate,天冬酰胺 Asparagine,2-氨基4-酰胺基丁酸,谷氨酸 Glutamate,含酰胺氨基酸,谷氨酰胺 Glutamine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,碱性氨基酸, -氨基-胍基戊酸,精氨酸 Arginine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine,，-二氨基己酸,赖氨酸 Lysine,脂肪族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,芳香族氨基酸, -氨基-苯基丙酸,苯丙氨酸 Phenylalanine,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,苯丙氨酸 Phenylalanine,酪氨酸 Tyrosine,-氨基-对羟苯基丙酸,芳香族氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,杂环氨基酸,碱性氨基酸, -氨基-咪唑基丙酸,组氨酸 Histidine,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,碱性氨基酸,组氨酸 Histidine, -氨基-吲哚基丙酸,色氨酸 Tryptophan,杂环氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类R的化学结构,杂环亚氨基酸,-吡咯烷基-羧酸,脯氨酸 Proline,2、根据R的极性（1）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp（2）不带电荷极性氨基酸：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys（3）带电荷极性氨基酸：Lys、Arg、His、Asp、Glu,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类,3、根据来源分：内源氨基酸和外源氨基酸4、根据营养学角度分：必需氨基酸和非必需氨基酸Ile Met Val Leu Trp Phe Thr Lys一 家 写 两 三 本 书 来,蛋白质的氨基酸组成,蛋白质中几种重要的稀有氨基酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类是否组成蛋白,非蛋白氨基酸,H2N-CH2-CH2-COOH H2N-CH2-CH2-CH2-COOH,-丙氨酸,-氨基丁酸,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类是否组成蛋白,作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Ala作为一些重要代谢物的前体或中间体:-丙氨酸、鸟氨酸、胍氨酸 (尿素)作为神经传导的化学物质：-氨基丁酸有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体（刀豆氨酸）,非蛋白氨基酸存在的意义：,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的分类是否组成蛋白,高熔点。一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。氨基酸一般有味。,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质,(四) 氨基酸的理化性质1 、 氨基酸的一般物理性质,1、氨基酸的一般物理性质氨基酸的光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,蛋白质的氨基酸组成,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质,比尔朗伯定律：在特定波长下，溶液中物质的光吸收与其浓度C（以mmol-1为单位）和溶液中光径长l（以cm为单位）成正比。A=Cl,例2.1假定酪氨酸在275nm时水溶液中的为1420Lmol-1cm-1,则光径1cm时A为0.71，那么酪氨酸在溶液中的浓度是多少？(0.5 mmolL-1 ),蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质,摩尔吸光系数,2、氨基酸的两性性质和等电点,不带电形式,两性离子形式,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质,PI：称为该氨基酸的等电点，即氨基酸所带正负电荷数量相等时的溶液的pH。,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质两性解离和等电点,中性氨基酸： pI=(pK1+pK2)/2pK1为-羧基的解离常数,pK2为-氨基的解离常数。,氨基酸PI可由其分子上解离基团的解离常数来计算：,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质两性解离和等电点,氨基酸等电点的计算,酸性氨基酸： pI=(pK1+pKR-COO-)/2碱性氨基酸： pI=(pK2+pKR-NH2)/2,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质两性解离和等电点,3、氨基酸的化学反应,亚硝酸盐反应烃基化反应酰化反应西佛碱反应,侧链反应,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质,成盐成酯反应成酰氯反应叠氮反应,与茚三酮反应,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,脯氨酸与茚三酮反应的产物为黄色化合物,与甲醛的反应（氨基酸的甲醛滴定法）,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,与2,4-二硝基氟苯(2,4-DNFB)的反应,用途：用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,黄色,Sanger反应,烃基化反应,与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应,DNS-氨基酸,用途：反应用于蛋白质的N-末端氨基酸标记和微量氨基酸的定量测定。,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,有很强的荧光,与异硫氰酸苯酯(PITC)反应(Edman反应),蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,用途：重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,苯硫乙内酰脲-Aa,亚硝酸反应,用途：范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应。,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,西佛碱反应:氨基与醛类化合物反应生成弱碱,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,成盐成酯反应,用途：保护羧基，活化氨基。,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,氨基酸乙酯的盐酸盐,乙醇,干燥HCI,叠氮反应,用途：活化羧基，用于肽的人工合成。,蛋白质的氨基酸组成氨基酸的理化性质化学反应,酰化氨基酸甲酯,酰化氨基酸酰肼,酰化氨基酸叠氮,肽：一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。氨基酸之间的连接键称肽键（酰胺键）。,四.肽,寡肽：25个氨基酸残基以下。多肽：多于25个氨基酸残基。,肽,二肽：两个氨基酸组成的肽。,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,1、每种肽也有其晶体，晶体的熔点很高。2、在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离的基团。3、每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。,肽,（一）肽的重要理化性质,4、肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、 Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应。,活性肽（active peptide）：分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,肽,（二）天然存在的重要多肽,肽,保护体内蛋白质和酶处在活性状态,肽,蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。,五.蛋白质的结构,蛋白质有四种结构层次：一级结构（primary）二级结构（secondary）三级结构（tertiary）四级结构（quaternary）,蛋白质的结构,（一）蛋白质的一级结构（化学结构）,蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。国际纯化学与应用化学委员会(IUPAC),蛋白质的结构,胰岛素的一级结构,蛋白质的结构一级结构,多肽链在一级结构的基础上，按照一定的方式有规律的旋转或折叠形成的空间构象。其实质是多肽链在空间的排列方式。,（二）蛋白质的二级结构,蛋白质的结构,-螺旋、-折叠、 -转角、自由回转,-螺旋（ -helix ）,蛋白质的结构二级结构,螺旋上升一周包含3.6个氨基酸残基；每个残基沿轴旋转100。；每两个残基之间的距离为0.15nm；螺距0.54nm; -螺旋中氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行。-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种。天然蛋白质的-螺旋多为右手螺旋。,蛋白质的结构二级结构,-螺旋结构要点：,氨基端,羧基端,影响蛋白质-螺旋结构稳定的因素,1.脯氨酸 Pro(羟脯氨酸),3.相同电荷的氨基酸,2.多聚异亮氨酸,蛋白质的结构二级结构,有较大的R 基,造成空间阻碍,蛋白质的结构二级结构,-折叠结构(-pleated sheet),多肽链呈锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构；相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm，侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间有氢键相连；有平行式和反平行式两种。,-折叠结构要点：,蛋白质的结构二级结构,蛋白质的结构二级结构,N端,C端,蛋白质的结构二级结构,N端,C端,N端,C端,蛋白质的结构二级结构,-转角 (-turn),主要存在于球状蛋白分子中。,没有一定规律的松散肽链结构。 酶的活性部位。,蛋白质的结构二级结构,自由回转,超二级结构:是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。,蛋白质的结构二级结构,、 -曲折等,结构域：球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合成三级结构。,蛋白质的结构二级结构,蛋白质的结构二级结构,（三）蛋白质的三级结构,一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。,蛋白质的结构,（四）蛋白质的四级结构,二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链(亚基)，彼此借次级键相连，形成一定的空间结构，称为四级结构。,蛋白质的结构,亚基(subunit),蛋白质的结构四级结构,具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基或亚单位，亚基可以相同，亦可以不同。四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。亚基与多肽链的关系单独亚基，无生物学功能，当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后，才有功能。亚基聚合的动力：疏水作用、离子键、氢键,蛋白质的结构四级结构,胰 岛 素,共价键,次级键,化学键,肽键,一级结构,氢键,二硫键,二、三、四级结构,疏水键,盐键,范德华力,三、四级结构,（五）蛋白质分子中的共价键与次级键,蛋白质的结构,非共价键,前体与活性蛋白质一级结构的关系,六.蛋白质结构与功能的关系 (一） 一级结构与功能的关系,蛋白质分子结构与功能的关系一级结构,同源蛋白质有顺序同源性,蛋白质的一级结构与分子病,蛋白质分子结构与功能的关系一级结构,-链 1 2 3 4 5 6 7 Hb-A N- Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-LysHb-S N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys,蛋白质分子结构与功能的关系一级结构,镰刀形细胞贫血病,（二）蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质分子结构与功能的关系空间结构,（一）蛋白质相对分子量,七.蛋白质的性质,相对分子质量（Mr）很大分子质量（Da，kDa）摩尔质量（kgmol-1）如血清蛋白的Mr为66000，分子质量是66kDa，而摩尔质量是66kgmol-1。,蛋白质的性质,蛋白质分子质量测定,测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。超离心法：蛋白质颗粒在2550104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数(s)：单位(cm)离心场里的沉降速度。沉降系数的单位常用S，1S=110-13(s),（二）蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质的性质,蛋白质和多肽一样，能够发生两性解离，具等电点。在等电点 (Isoelectric point PI)时，溶解度最小，在电场中不移动。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳。,电泳,利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,蛋白质的性质两性电离,自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中电泳。区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。,（1）纸上电泳：用滤纸（醋酸纤维薄膜）作支持物。（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,蛋白质的性质两性电离,圆盘电泳,平板电泳,蛋白质的性质两性电离,由于蛋白质的分子量很大（1-100nm），它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。可用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等,（三）蛋白质的胶体性质,蛋白质的性质,蛋白质溶液稳定的原因：表面分布很多极性基团，易吸附水，形成水膜（水化层）；带相同电荷，互相排斥，不易沉淀。,蛋白质的性质,蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。,（四）蛋白质的沉淀反应,蛋白质的性质,在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。,可逆沉淀,等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法,蛋白质的性质沉淀反应,在强烈条件下，破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性及蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，又称为变性沉淀。加热沉淀强酸碱沉淀重金属盐沉淀生物碱沉淀,不可逆沉淀,蛋白质的性质沉淀反应,（五）蛋白质的变性,天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性。,蛋白质的性质,蛋白质的性质变性,蛋白质变性后的表现：生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；光吸收系数增大；组分和分子量不变。,引起蛋白质变性的主要因素：,温度（热、冷）强酸、强碱尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应） H2N-C-NH2 H2N-C-NH2+Cl-表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）,O,NH2,蛋白质的性质变性,蛋白质的复性,定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。,蛋白质的性质变性,蛋白质的性质,（六）蛋白质的颜色反应,（六）蛋白质的颜色反应,蛋白质的性质,蛋白质的性质颜色反应,红紫色络合物,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,（七）蛋白质的紫外吸收,蛋白质的性质,八、蛋白质的分离与分析技术,1、根据蛋白质的溶解度不同进行分离 中性盐,有机溶剂,强沉淀剂 2、根据蛋白质分子的大小进行分离 透析和超滤，凝胶过滤 3、根据蛋白质所带电荷的不同 电泳 离子交换层析,九、蛋白质分子中氨基酸序列的确定,多肽链的分离：8M尿素或6M盐酸胍或高浓度盐拆分亚基二硫键的断