重组人生长激素对重度烧伤低龄患儿免疫功能影响的随机对照临床试验.doc

重组人生长激素对重度烧伤低龄患儿免疫功能影响的随机对照临床试验 中华烧伤杂志2019年10月第35卷第10期Chin JBurns，October2019，V0135，No10重组人生长激素对重度烧伤低龄患儿免疫功能影响的随机对照临床试验论著小儿烧伤梅爱莲邱林张栎袁心刚刘燕李天武丁雄辉重庆医科大学附属儿童医院烧伤整形外科，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发展重大疾病国家国际科技合作基地，儿科学重庆市重点实验室400014通信作者邱林，Emailqiulinll8126con【摘要】目的初步探讨重组人生长激素(rhGH)对重度烧伤低龄患儿免疫功能的影响。 方法xx年7月一2018年7月笔者单位收治符合人选标准的重度烧伤低龄患儿30例，按随机数字表法分为rhGH组15例，男10例、女5例，年龄(2210)个月、对照组15例，男8例、女7例，年龄(217)个月，行前瞻性随机双盲对照试验。 对照组患儿入院后行抗休克、抗感染、创面护理等治疗。 rhGH组患儿在上述治疗基础上，伤后第3天开始皮下注射rhGH02Iukgd，每晚睡前1次，连续治疗7d。 rhGH治疗前及治疗 3、7d，分别抽取2组患儿空腹外周静脉血，采用血糖仪检测血糖水平，流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例、CD4+CD8+T淋巴细胞比值、CD3+T淋巴细胞比例、CDl9+B淋巴细胞比例，酶联免疫吸附测定法检测血清IgA、IgG、补体c3质量浓度。 对数据行Fisher确切概率法检验、独立样本检验、重复测量方差分析并行Bonferroni校正、MannWhitney U检验。 结果 (1)2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d血糖水平均相近(t=0 474、1 652、1997，P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d血糖水平(6910)、(7711)mmolL均明显高于rhGH治疗前(594-09)mmolL，P005。 对照组患儿rhGH治疗7d血糖水平明显高于rhGH治疗前(P005)；rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+T淋巴细胞比例(44722)明显高于对照组(36522)，f=2624，P005。 rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+T淋巴细胞比例明显高于rhGH治疗前(P005)。 (3)rhGH组患儿rhGH治疗3d CD8+T淋巴细胞比例明显低于对照组(t=2107，P005)。 (4)rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+CD8+T淋巴细胞比值(236020)明显高于对照组(172020，t=2285，P005)，rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+CD8+T淋巴细胞比值较rhGH治疗前(204019)升高(P005)，rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d CD3+T淋巴细胞比例均明显高于rhGH治疗前(P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d血清IgA、补体c3质量浓度明显高于rhGH治疗前(PO05)The91ucose1evels of children in group rhGH on the3rd and7th dayof rhGHtreatment(6910)and(7711)mmolLwere significantly higher than(5909)mmolL before rhGH treatment(P005)The glucose1evel of children incontr01group on the7th davof rhGHtreatment was significantlyhigher than that before rhGH treatment(PO05)The percentagesof CD4+T lymphocytes ofchildren in group rhGH on the7th dayof rhGHtreatment(44722)was significantlyhigher than(36522)in control group(#=2624，P005)The percentageof CD4+T1ymphocytes ofchildreningroup rhGHon the7th dayof rhGHtreatment was significantlyhigher thanthat before rhGHtreatment(P005) (3)The per-cent89eof CD8+T lymphocytesof childreningrouprhGHon the3rd dayof rhGHtreatment wassignificantly10wer thanthat incontrolgroup(=2107，P005) (4)The ratioof CD4+T lymphocytesto CD8+T1ympho。 ytesof childreningrouprhGHon the7th d8yof rhGHtreatment(236O20)was significantlyhigherthan172020incontrol group(=2285，P005)The ratioof CD4+T lymphocytestoCD8+T1ymphocytesofchildrenin grouprhGHonthe7th dayofrhGHtreatmentwassignificantly higherthan204019beforerhGHtreatment(P005)The percentagesofCD3+T1ymphocytesofchildreningrouprhGHonthe3rd and7th dayofrhGHtreatmentweresignificantIy higherthanthe percentagebeforerhGHtreatment(PO05)Themass concentTationof serumIgA and plement C3ofchildreningrouprhGHonthe3rdand7th dayofrhGH treatmentwassignificantlyh培herthanthatbeforerhGHtreatmen“P005)Conclusions rhGHhaslittle effecton humoralimmunity ofyounger childrenwithsevereburn injurieswith limitedinnuence onCDl9+B lymphocyte，massconcentrationof serumIgA，IgG，andplementC3It m8y improvethe cellu一1ar immunityfunction mainlythrough promotingthe releaseofCD4+T lymphocyte，reducing therelease ofCD8+T lymphocyteIt canbe usedin clinicaltreatment ofyoungerchildrenwithsevereburninjuries【Key words】Burns；Immunomodulation；Growth hormoneFundprOgramMedical andScienti“c ResearchProgram ofChongqing MunicipalHealth andFamilyPlanning Commissioninxx(xxMSXM044)；Medical ResearchProiect ofChildrensHospitalofChongqing MedicaIUniversity inxx(1cyjxx11)727万方数据中华烧伤杂志2019年10月第35卷第10期Chin JBurns，October2019，V0135，No10DOI103760cmajissn10092587201910005在全球范围内，严重烧伤每年导致约18万人死亡，数百万非致命性烧伤患者遭受严重和终身的身体和心理疾病?。 严重烧伤是005)，见表1。 表12组重度烧伤低龄患儿一般资料比较性别(例)年龄(个月，组别例数 一、男女5j体质量烧伤总面积(kg，is)(TBSA，is)rhGH组15105221013037235对照组158721711013205注“一”表不无此统计量值；rhGH为重组人生长激素，TBSA为体表总面积13主要仪器与试剂GLM一71血糖仪购白青岛厚美德生物科技有限公司，离心机购自德国Eppendorf公司，FACSCanto流式细胞仪购自美国Beeton Dickinson公司，Array360型全自动蛋白测定仪购自美国Beckman公司。 碳酸氢钠、氯化铵购自重庆博艺化学试剂有限公司，乙二胺四乙酸(EDTA)购自成都科龙化工试剂厂，异硫氰酸荧光素标记的抗人CD3抗体、藻红蛋白标记的抗人CDl6+56抗体、多甲藻黄素叶绿素蛋白质复合物一花青素55标记的抗人CD45抗体、藻蓝蛋白7标记的抗人CD4抗体、别藻红蛋白标记的抗人CDl9抗体、别藻红蛋白一花青素7标记的抗人CD8荧光单克隆抗体试剂盒购自北京同生时代生物技术有限公司，IgA、IgG、补体C3ELISA检测试剂盒购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。 14治疗方法由研究组成员配制rhGH试剂，由临床医师(药物)对A组患儿给药，并记录相关试验数据。 万方数据中华烧伤杂志2019年10月第35卷第10期Chin JBurns，October2019，V0135，No10对照组患儿入院后行早期抗休克、抗感染、止痛、营养支持等治疗，早期选择第一代头孢抗感染，中后期根据药物敏感试验选择敏感性抗生素抗感染。 创面均予体积分数1聚维酮碘清洗，并外敷适量莫匹罗星软膏、外喷适量阿米卡星洗剂，采用包扎疗法，每天换药1次，烧伤辐射远红治疗仪照射保暖。 深、度创面溶痂后培养肉芽组织，再行植皮手术。 rhGH组在上述治疗基础上，伤后第3天开始皮下注射rhGH(长春金赛药业有限责任公司)02IUkgd，每晚睡前1次，连续治疗7d”。 15检测指标rhGH治疗前及治疗 3、7d，抽取rhGH组患儿空腹外周静脉血41mL，20mL血样本置于EDTA抗凝管中，20mL血样本置于促凝管中；对照组患儿于同时间点取血。 151血糖水平取01mL新鲜静脉血采用血糖仪检测血糖水平。 152淋巴细胞分类取流式进样管，标记管号 1、 2、 3、 4、5，每管分别加入异硫氰酸荧光素标记的抗人CD3抗体、藻红蛋白标记的抗人CDl6+56抗体、多甲藻黄素叶绿素蛋白质复合物花青素55标记的抗人CD45抗体、藻蓝蛋白7标记的抗人CD4抗体、别藻红蛋白标记的抗人CDl9抗体、别藻红蛋白花青素7标记的抗人CD8荧光单克隆抗体5L。 移液枪从2mL抗凝血样本中吸取50LLL样本分别加入流式进样管 1、 2、 3、 4、5，滴加1滴鞘液，充分混匀，室温避光放置10min。 摇匀流式进样管中样本，加满氯化铵溶血剂，避光放置10min，300g离心3min。 45。 倾斜倒掉上清液，每管留下约200仙L液体，采用流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例、CD4+CD8+T淋巴细胞比值、CD3+T淋巴细胞比例、CDl9+B淋巴细胞比例。 153血清Ig及补体c3质量浓度取20mL促凝血凝血后4下以离心半径77em，3000rmin离心20min，分离血清，采用IgA、IgG、补体c3ELISA检测试剂盒检测血清IgA、IgG、补体C3质量浓度，采用蛋白测定仪测定吸光度值。 16统计学处理采用SPSS220统计软件对数据进行处理。 计数资料以频数表示，行Fisher确切概率法检验(软件自动略去该统计量值)。 计量资料中符合正态分布的数据以iS表示，组间比较行独立样本t检验并行Bonferroni校正、重复测量方差分析，组内比较行重复测量方差分析的Bonferroni校正(软件自动略去该统计量值)。 计量资料中非正态分布数据以M(P，P。 ，)表示，行MannWhitney U检验。 2结果21血糖水平2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d血糖水平均相近(P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d血糖水平均明显高于rhGH治疗前(P005)，对照组患儿rhGH治疗7d血糖水平明显高于rhGH治疗前(P005)。 见表2。 表22组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点血糖水平比较(mmolL，孑s)t值P值047406391652O11019970056注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=5003，P0033；时间因素主效应，F=16752，P0001；两者交互作用F=0720，P=0491；与组内rhGH治疗前比较，8P005)，rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+T淋巴细胞比例明显高于对照组(P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+T淋巴细胞比例明显高于rhGH治疗前(P005)。 见表3。 表32组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点CD4+T淋巴细胞比例比较(，孑s)t值尸值O371O7141553rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=2262，P=0144；时间因素主效应，F=9340，P0001；两者交互作用，F=6892，P=0002；与组内rhGH治疗前比较，8P005)，rhGH组患儿rhGH治疗3d CD8+T淋巴细胞比例明显低于对照组(P005)。 见表4。 万方数据730中华烧伤杂志2019年10月第35卷第10期Chin JBurns，October2019，V0135，No10表42组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点CD8+T淋巴细胞比例比较(，孑s)注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=4556，P=0042；时间因素主效应，F=3305，P=0050；两者交互作用，F=0112P=086524CD4+CD8+T淋巴细胞比值2组患儿rhGH治疗前及治疗3d CD4+CD8+T淋巴细胞比值均相近(P005)，rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+CD8+T淋巴细胞比值明显高于对照组(P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗7dCD4+CD8+T淋巴细胞比值较rhGH治疗前升高(P005)。 见表5。 表52组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点CD4+CD8+T淋巴细胞比值比较(孑s)注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=3244，P=0082；时间因素主效应，F=3223，P=0055；两者交互作用，F=1632，P=0208；与组内rhGH治疗前比较，8P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d CD3+T淋巴细胞比例均明显高于rhGH治疗前(P005)。 见表6。 表62组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点CD3+T淋巴细胞比例比较(，孑s)26CDl9+B淋巴细胞比例2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d CDl9+B淋巴细胞比例均相近(P005)。 2组患儿rhCH治疗 3、7d CDl9+B淋巴细胞比例均与组内rhGH治疗前相近(P005)。 见表7。 表72组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点CDl9+B淋巴细胞比例比较(，孑s)注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=1965，P=0172；时间因素主效应，F=0963，P=0388；两者交互作用，F=1144，P=032627血清IgA质量浓度2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d血清IgA质量浓度均相近(P005)。 rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d血清IgA质量浓度均明显高于rhGH治疗前(P005)。 见表8。 表82组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点血清IgA质量浓度比较(gL，孑s)注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=0002，P=0966；时间因素主效应，F=5994，P=0007；两者交互作用，F=3617，P=0042；与组内rhGH治疗前比较，8P005)。 见表9。 表92组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点血清IgG质量浓度比较gL，M(P，P，；)注rhGH为重组人生长激素注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=0001，P=o978；时间因素主效应，F6776，Po004；两者交互作用，F29血清补体C3质量浓度6111，P0006；与组内，hGH治疗前比较，aP005)。 rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d血清补体c3质量浓度均明显高于rhGH治疗前(P005)。 见表10。 表102组重度烧伤低龄患儿rhGH治疗各时间点血清补体c3质量浓度比较(gL，孑S)注rhGH为重组人生长激素；处理因素主效应，F=2006，P=0168；时间因素主效应，F=13029，P=0001；两者交互作用F=1611，P=0209；与组内rhGH治疗前比较，8P0053讨论rhGH在严重烧伤中具有积极意义，但其使用方法、使用剂量及疗程尚不统一。 目前国内常用剂量为0204IUkgd，该范围内剂量越大越受益；应用时机烧伤后37d急性休克期过后或术后第1天开始使用，疗程推荐使用2周”。 烧伤后3d，低龄患儿正规积极抗休克治疗，急性应激(高血糖、休克等)渐平复，逐渐出现液体回吸收，细菌、毒素回吸收入血，是脓毒症出现的高峰。 该阶段Ig丢失，机体免疫力下降。 笔者设计于伤后3d开始使用rhGH，避免急性休克期，且接近炎症介质、毒素、免疫调节产生的始动阶段，减少脓毒症的产生。 研究显示，对于中等面积受试患者，小剂量rhGH可促进创面愈合、增强免疫功能；大剂量疗效更佳，但不良反应相应增加1。 因此本研究对低龄患儿，从疗效及安全性考虑选择了从02IUkgd。 小剂量开始，疗程1周，以避免不良反应。 重度烧伤后，机体内生长激素水平急剧上升，但胰岛素样生长因子I水平却下降，出现获得性生长激素抵抗(AGHR)?。 重度烧伤低龄患儿常因并发AGHR使rhGH的促合成效应受到明显抑制，而高血糖、体液潴留、胰岛素抵抗等不良效应增强，因而对儿童使用rhGH应更加谨慎。 本研究对低龄患儿血糖进行监测，结果显示2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d血糖水平均相近，说明rhGH可能对血糖水平影响不大，这与贾军等1研究结果rhGH可明显升高血糖不同，可能与rhGH剂量小有关。 说明小剂量rhGH对重度烧伤低龄患儿的治疗可能是安全的，但本组样本量较小，仍需临床进一步证实。 淋巴细胞分类是体现免疫功能最重要的指标”。 T淋巴细胞可分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞两大亚群，CDd+T淋巴细胞为免疫辅助性细胞，参与体液免疫和细胞免疫；CD8+T淋巴细胞是细胞毒性细胞，作用是识别和杀伤靶细胞，参与细胞免疫，抑制免疫反应过度激活”?。 CD4+CD8+T淋巴细胞比值是检测患儿免疫抑制状态的指标。 CD3+T淋巴细胞反映成熟T淋巴细胞数量。 本研究显示重度烧伤后，与对照组比较，rhGH组患儿rhGH治疗7d CD4+T淋巴细胞比例明显升高，rhGH治疗3d CD8+T淋巴细胞比例明显降低，rhGH治疗7d CD4+CD8+T淋巴细胞比值明显升高，CD3+T淋巴细胞比例rhGH治疗各时问点变化不明显；与组内rhGH治疗前比较，rhGH组患儿rhGH治疗7dCD4+T淋巴细胞比例和CD4+CD8+T淋巴细胞比值明显升高，rhGH治疗 3、7d CD3+T淋巴细胞比例均明显升高。 说明rhGH可能促进CD4+T淋巴细胞释放、降低CD8+T淋巴细胞释放，从而升高CD4+CD8+T淋巴细胞比值，其中CD4+T淋巴细胞对CD4+CD8+T淋巴细胞比值起主要影响作用，但成熟T淋巴细胞总量变化不明显。 其机制可能是 (1)存在骨髓、胸腺中淋巴细胞表面有生长激素受体，rhGH与生长激素受体相结合，促进淋巴细胞的分化、成熟。 (2)rhGH通过调节T淋巴细胞的功能，促进CD8+T淋巴细胞凋亡，减少CD4+T淋巴细胞的凋亡。 本研究中rhGH主要在治疗7d起效，可能与儿童烧伤后体内生长激素分泌下降、储备不足有关；rhGH药物半衰期短为23h，在儿童中稍长，小剂量02IUkgd“给药使机体需较长时间达到稳定的血药浓度，加之低龄儿童尚处于生长发育期，对rhGH的需求较成人高，故rhGH起效时间较晚。 CDl9+是B淋巴细胞的标志物，主要与体液免疫相关，本研究显示2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d CDl9+B淋巴细胞比例均相近，说明rhGH对B淋巴细胞比例影响不大。 IgA、IgG对肠道黏膜免疫有重要的保护作用，本研究显示2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d血清IgA、IgG质量浓度均相近，但rhGH组患儿rhGH治疗 3、7d血清IgA质量浓度均明显高于组内rhGH治疗前，表明rhGH对血清IgA、IgG质量浓度影响不明显，但血清IgA质量浓度有升高趋势。 在临床中观察rhGH组患儿食欲、营养状况较对照组好，较少出现腹泻情况，说明临床中rhGH万方数据732中华烧伤杂志2019年10月第35卷第10期Chin JBurns，October2019，V0135，No10可能提高重度烧伤低龄患儿IgA水平，调节肠道菌群比例，减轻肠道细菌移位。 补体c3是补体系统中含量最多、最重要的成分，对免疫活动起调节作用。 2组患儿rhGH治疗前及治疗 3、7d血清补体c3质量浓度均相近，提示rhGH对补体c3合成影响不大。 总之，rhGH对重度烧伤低龄患儿体液免疫的影响小，需进一步研究。 综上所述，rhGH能通过提高细胞免疫功能有效改善重度烧伤低龄患儿免疫功能紊乱情况，促进患儿康复，但对体液免疫的影响小。 本研究使用单中心、随机、双盲、空白对照的方法初步探讨rhGH治疗对重度烧伤低龄患儿免疫功能的作用，但因国人对激素的认知不足，试验过程中患儿家长依从性差，剔除病例较多，导致样本量少，检验效能较低，得出的结论可能有一定偏差，希望以后能通过更长时间或更好地与患者家属沟通，得到其理解，扩大样本量，再得出更有科学意义的结论，为使用rhGH治疗重度烧伤低龄患儿提供科学的临床依据。 利益冲突所有作者均声明不存在利希冲突参考文献1Li Z，Maitz PCell therapyfor severeburn woundhealingJBurns Trauma，2018，613DOI101186s41038Haines E，Fairbrother HOptimizing emergencymanagement toreducemorbidity andmortality inpediatricburn patientsJPediatr EmergMed Pract，xx，12 (5)1-2513J JeschkeMG，Finnerty CC，KulP GA，et alCombinationofre-binanthumangrowth hormoneand propranololdecreases hypermetabolism andinflammation inseverely burnedchildren【J 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