艾滋病检测技术新进展

艾滋病检测技术新进展及其应用,郭志宏浙江省疾病预防控制中心,内容提要,1.HIV急性期感染或窗口期感染检测（Ab/Ag联合检测和集合PCR）2.婴幼儿早期诊断 （nest RT-PCR）3.快速检测策略及质控,1、HIV-1持续流行： 全球HIV流行和AIDS仍继续增加，尤其是MSM同性恋人群，多达50% HIV 传播发生在疾病急性和早期，（流行病学意义）2、高病毒RNA水平： 性传播感染仍具首位，生殖道 HIV RNA 水平相当于血液中HIV RNA水平。高病毒载量、独特的病毒特性以及缺乏中和抗体，急性期感染者感染性极高。VL10 M copies/mm33、极易垂直传播： 怀孕妇女感染HIV非常常见，增加HIV垂直传播的危险。2011年4月全国报告的HIV感染者（5560例）中，母婴传播占1.3%；AIDS病人（2806例）中，母婴传播占1.0%。,公共卫生意义：HIV-1 流行形势严峻,为什么HIV急性感染（AHI）越来越受到重视？,4、应尽早尽快进行诊断： HIV感染急性期，感染者无症状和流感样症状而经常漏检而误诊，感染者本人不知自己感染状态，极易在高危人群中传播5、应尽早进行人群干预： 实时对感染者及其配偶、孕妇感染者及其婴儿进行干预，知晓感染状态，减少危险性行为；了解和干预复杂的性传播网6、应尽早进行病毒干预： 在AHI时期进行可能的干预以限制HIV复制和整合入病毒潜伏池、（整合后不可治愈），早期抗病毒治疗的必要性(转变观念)7、指导疫苗研究： 基于急性期感染时期的传播性/奠基者病毒的特性8、建立人类自然模型： 研究AHI个体，为详细了解人类HIV传播事件提供最好的机会,公共卫生意义：早诊断、早干预、早治疗、降两率、指导疫苗研究,为什么HIV急性感染（AHI）越来越受到重视？,方法：前瞻性随访高危人群队列发现阳转感染者（MSM,IDU, SW,单阳伴侣） 限制：1）前瞻性随访HIV阴性人群的巨额花费； 2）在阳转时刻或接近阳转时难以找到研究对象，难以采集到急性期血 清阴性病毒血症期峰值的样本；（美国国防部联手NIH 已经启动疫苗免疫性队列研究 RV217， 每周二次检测HIV RNA，试图发现AHI；我国十一五重大专项也启动了急性期感染的研究）,前瞻性队列研究：高危人群,横断面研究：普通人群,血液中心通常使用集合（6-96份血浆）NAT筛查，阳性集合拆分并检测出个体感染者，使用病毒特异性“区别”NAT检测确认，阳性者纳入转诊和报告系统 美国北卡卫生部门制定和实施了全州所有公共HIV检测点筛查AHI规划，对所有抗体阴性样本进行集合NAT RNA检测。及时转诊、咨询、治疗和前瞻性研究,如何发现 HIV急性感染AHI？,RNA+ Ab-,P24+ Ab -,血清阳转后的方法,RNA,p24,Ab,血清阳转,抗体检测临界值 特异性抗体比例,时间,反应指标,感染,血清阳转前的方法,怎样检测HIV-1早期感染?,从感染HIV到抗体呈阳性反应这段时间血浆中含有高浓度HIV RNA有很高的传染性现在普遍认为2周3个月,个别案例达6个月。,HIV血清阳转窗口期,HIV感染各种检测方法的窗口期,HIVAb检测（第三代试剂）：窗口期约28天HIVAb/Ag联合检测（第四代试剂）：窗口期约15天核酸检测： 窗口期约10天,病毒载量值范围为3.846.84Log10Copies/mL；28例窗口期病例，病毒载量百万级有10份（35.71%）；十万级9份（32.14%）；万级的样品7份（25%）；万级以下的样品2份，占总样品数的7.14%。,窗口期感染者的病毒学特征,40份WB不确定样品WB条带,HIV急性期感染或窗口期感染检测方法,1.Ab/Ag联合检测: ELISA2.HIV RNA检测: 集合PCR,HIV Ab/Ag联合检测,检测早期HIV感染的效果与单独HIV-1抗原的试剂相当与RT-PCR方法相比，平均滞后时间是大约3.23天与第三代抗体试剂相比，窗口期缩短了1.56 到 5.32天检测献血员的特异性是99.80%第四代试剂的敏感性和特异性均有所提高,HIV Ab/Ag联合检测试剂的原理,HIV Ab/Ag特点,HIV-Ab与HIV-Ag双检测系统 HIV-Ag和HIV P24抗体共同包被 HRP标记HIV-Ag和HRP标记亲和素共同组成酶标试剂双抗原夹心法测HIV-Ab 包被抗原+HRP标记抗原双抗体夹心LAB法测HIV-Ag 包被抗体生物素标记抗体HRP标记亲和素生物素-亲和素反应系统应用,HIV-Ag/Ab试剂对BBI panel检测结果,24种国外抗体试剂窗口期与万泰试剂一致，均27天。 ABBOTT（2种）、万泰和伯乐抗原试剂窗口期均为7天，灵敏度一致。,集合HIV RNA RT-PCR样本的路线,集合的拆分检测路线,Low：低于检测限,HIV窗口期感染样品各级POOL检测结果,50份标本混合阳性 每10份标本再检测 阳性每一份标本再检测,集合HIV核酸检测用于血液筛查,集合 HIV RNA 检测方法用于在HIV抗体阴性的血清（血浆）样本中筛查处于急性感染期HIV RNA阳性的样本。,注* RT1和RT2检测均为阴性的样品为按阴性咨询同时，为进一步排除假阴性的样品将保留血浆，集中进行ELISA复检，ELISA复检为阳性的样品进一步做WB确认，同时进行随访。,窗口期检测程序,应用集合PCR技术发现窗口期感染者,MSM VCTIDU 筛查- 筛查+ 集合PCR WB +结合流行病史，判断窗口期感染,MSM人群早期感染建议检测流程,2017/11/23,男男性行为人群HIV-1早期感染检测策略及新发感染率研究,婴幼儿HIV感染的诊断,HIV感染产妇生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸检测进行早期HIV感染诊断。逆转录PCR（RT-PCR）方法，一般需扩增HIV gag 和pol 和env 基因片段。如果儿童第一次采血时已满12个月，则应首先进行HIV抗体检测。对于抗体阳性者进行HIV核酸检测。如果已满18个月，不做核酸检测。,感染婴儿平均S/CO值随月龄变化曲线（24个感染婴儿(3个死亡)，82个样本）n: 样本数,婴幼儿感染诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测,核酸检测流程,快速检测，是艾滋病实验室多了一种检测方法。快速检测，是为了更多、更快的的发现感染者。快速检测，不是为了取代实验室，但不能因为有了实验室而放弃使用快速检测。,快速检测,“五扩大七加强”,扩大宣传教育覆盖面扩大监测检测覆盖面扩大预防母婴传播覆盖面扩大综合干预覆盖面扩大抗病毒治疗覆盖面加强血液管理加强医疗保障加强关怀救助加强权益保护加强组织领导加强防治队伍建设加强国际合作,国务院 国发【2010】48号：,扩大监测检测覆盖面,要进一步加强监测检测网络建设，依托现有医疗卫生资源，配备必要的设备和人员，扩大检测服务范围，推广使用快速简便的检测方法，提高检测可及性。组织各级各类医疗卫生机构主动开展艾滋病病毒检测咨询。,建立快速检测点，扩大检测覆盖率,我国地域辽阔，在一些有检测需求但尚不具备条件建立实验室的医疗机构、农村乡（镇）卫生院、社区卫生服务中心和艾滋病自愿咨询检测点（VCT）需要建立快速检测点，以扩大检测覆盖面、发现更多的艾滋病病毒感染者。,疫情的新特征（病人发现晚）要求开展快检以尽早尽快发现,增加检测可及性是中国控制艾滋病的关键,1.知晓 HIV感染状况能够得到有效的阳性的干预。2.通过行为改变可以减少2/3的HIV经性传播。3.及时的抗病毒治疗可以减少病毒载量从而减少二代传播 “治疗作为预防”90%以上的效能。4.如果有60%的HIV+知晓自己的感染状态并获得相应服务HIV疫情达到控制。5.为什么目前HIV+发现率不高6+快速检测阳性，一致性100%，中国艾滋病性病，2008年第3期）该比较的局限性：两种快速试剂均为进口试剂，没有对阴性样本进行对比。部分国产快速检测试剂质量需进一步提高,贵州： 快速检测试剂与ELISA WB符合性,贵州：母婴阻断示范区项目快检结果分析,艾滋病病毒抗体快速检测技术手册(2011年版）,1、人员要求2、检测点的设置3、要求与管理3、试剂选择4、样本采集及注意事项5、检测策略及流程6、实验记录7、结果报告与告知8、检测质量控制9、生物安全及个人防护。,人员要求,从事HIV快速检测的人员需有相关的检验或医学知识，经过县级以上相关专业技术部门培训，取得合格证书。 未经正规培训或培训后考核未合格的人员,不得进行快速检测工作。对从事快速检测的人员,应根据需要进行再培训。,检测点的设置,各省可根据艾滋病流行情况和防治工作整体需求，统筹考虑检测点设置，有效开展快速检测。根据当地艾滋病流行情况和实际需求，可在有检测需求、但不具备建立实验室条件的地方设置检测点。检测点可由当地艾滋病确证实验室或筛查实验室负责培训、验收，卫生行政部门负责审批，在当地卫生行政部门与省艾滋病确证中心实验室备案。,检测点的要求,快速检测所在房间温度可控，保证室内达到试剂要求的温度，有检测台面，光线充足，可以消毒。需配备快速检测所需物品，至少包括：普通冰箱、消毒与污物处理设备、一次性消耗品、安全防护用品和资料柜。严格按照快速试剂说明书要求检测，保存原始记录及必须参加省（地市级）组织的快速检测能力验证。,检测点的管理,省艾滋病确证中心实验室负责本省HIV快速检测的实施及其质量保证。统筹考虑检测点的发展与规划，组织本省快速检测能力验证活动。各市级艾滋病确证实验室指导本地检测点的建立与管理，进行人员培训、现场督导和质量管理。,快速检测试剂（RT）,是在ELISA基础上发展起来的一种检测技术，它用胶体金或硒标记抗原、抗体后以层析方法进行检测。突出优点为快速、试剂便于保存、检测不需要特殊设备并可以单份检测 ，比较适用于基层医疗单位和标本初筛。挑战：进一步提高检测灵敏度和特异性，实现检测多元化，进行定量和半定量检测胶体金纸条将会更加广泛地应用于各个领域。,艾滋病快速检测试验（RT）,快速HIV试剂的原理*颗粒凝集 （Particle Agglutination, PA)免疫渗漏 （Immunoconcentration, Flow through, FT)免疫层析 （Immunochromatograpy, lateral flow, IF),快速检测：胶体金（或胶体硒）原理和方法,原理包括HIV-和HIV-2抗原直接包被于硝酸纤维素膜上的检测线，将HIV抗体包被于质控线，通过利用胶体金(或胶体硒）标记HIV-1 和HIV-2抗原,采用免疫层吸双抗原夹心法原理来检测待测样品中可能存在的HIV抗体。操作方法操作简单，只需在加样处加上样品。,艾滋病快速检测试剂构造,艾滋病快速检测：胶体金（或胶体硒）结果判读,结果判读反应区和质控区均出现红色条带为阳性。质控区有条带，反应区无条带为阴性。反应区和质控区均无条带则实验无效。,艾滋病快速检测的优点,1.操作更快2.不需要成批实验3.不需要使用特殊仪器4.检测的当时就给出结果 5.只能采用经过SFDA批准的快速HIV抗体检测，以确保质量,快速检测试剂使用要求,必须使用经国家食品药品监督管理局注册批准的快速试剂。 试剂必须在有效期内使用。 根据检测目的选择试剂。初筛选择敏感性高的试剂，复检选择特异性高的试剂。 推荐使用临床评估质量好并且近几年连续考评结果稳定的试剂,快速检测试剂主要使用以下人群,MSM 现场干预VCT（自愿咨询检测）PMTCT（母婴阻断）和婚前检查扩大检测(乡镇卫生院、社区医疗卫生服务站）PITC（医疗机构主动提供检测咨询）,快速检测策略和流程,当检测点上有两种快速检测试剂时：常规检测当检测点上有两种快速检测试剂时：应急检测当检测点上只有一种快速检测试剂时,末梢血样本采集方法和注意事项,静脉血样本采集和注意事项,1、常规检测,样品,初筛试验,快检试剂1,阳性反应,阴性反应,复检试验,快检试剂1+快检试剂2,均阳性反应,一阴一阳,均阴性反应,送确证试验室,报告阴性,HIV抗体快速检测流程图,两种快检试剂同时检测样品,均阳性反应,一阴一阳,均阴性反应,送确证试验室,报告阴性,HIV抗体快速检测流程图,按疑似阳性咨询告知,按阴性咨询并告知,2、应急检测,样品,初筛试验,快检试剂,阳性反应,阴性反应,复检试验,将样本转送筛查实验室,均阳性反应,一阴一阳,均阴性反应,送确证实验室,报告阴性,HIV抗体快速检测流程图,3、只有一种快速试剂时,实验记录,可有数码影像资料或文字记录文字记录：检测序列号，人群来源，受检者姓名，年龄，性别，检测日期，检测试剂盒的名称，批号，有效期及检测日期，检测结果与检测人等。对快速检测呈阳性反应的就诊者，要收集个人的真实信息，登记身份证号码和联系方式（包括移动电话）。填写快速检测阳性反应样品送检单,快检质控,1. 样品要求唯一编号，实验前仔细核对，检查。2. 检测人员每日检查室内的温湿度，实验环境温湿度应在试剂盒操作说明书要求的范围内，试剂和样品应按要求存放，并做好记录。3. 检查是否有足够的试剂库存,明确试剂在有效期内，禁止使用过期试剂。4. 每批实验如果应用不同批号的试剂，应做好记录。,检测过程质控,1. 记录样品编码、姓名、试剂名称及批号、操作者姓名等。2. 核对样品标号，标记，防止错号。3. 收集并集中摆放全部待检样品，包括外部质控品。4.需要在冰箱保存的试剂，从冷藏环境中取出后放置室温，平衡后再使用。剩余的试剂条应立即放入自封袋中密封，按照试剂厂家提供的说明书开始操作。5. 建议每一次最多做10个样品，确保试纸条的编号与标本编号的准确对应，防止错号和交叉污染。6. 结果判定时，质控带必须出现实验才能成立。如未呈现质控条带，本次试验结果无效，样品须重检。7. 每个检测日做一次外部质控品，更换检测人员时;更换不同试剂批号时，更换不同的试剂包装时;更换不同的试剂厂家时均应一次外部质控品。,检测后质控,1.实验结果进行判读时，应保证判读地点光线充足。对于难以判读的条带，最好有2人判读。2.复核样品编号并填写试验结果。3.清洁并处理实验废弃物。4.向实验室负责人报告检测结果。5.检查试剂库存量，根据实际需要，提前向上级实验室申请补充。6.收到试剂时，试剂的外包装盒或内容物已损伤；标签出现错误、缺失或字迹模糊 (特别是产品厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期)；缺失目录或操作说明书；试剂盒内容物出现渗漏等。提示存在质量隐患，应详细记录。,部分快速检测试剂检测结果比较,（相同的样本，同一人员按说明书进行检测）,快速检测试验评价,试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有国内产品。一般可在1030min内判读结果。,快速试剂使用中存在的问题,快速检测只是初筛检测，存在一定的假阳性率和假阴性率；技术上属于主观判读，不具备标准化条件；快速检测的质量控制问题目前没有有效方法；存在较大的批间误差，加上不属于政策规定项目，风险较大，基层医疗卫生单位不愿意承担责任。担心敏感性不够高，不敢出阴性报告；,几种快速检测试剂质量事故,试剂厂家1（2007年12月29日）事件：X确证实验室报告厂家1（胶体金法）批号为V200707033对12份HIV-1抗体阳性的病人样品检测有6份呈假阴性反应。结果：通知辖区内的网络实验室暂停使用该厂家的HIV快速试剂，封存现有试剂，退回厂家 。,几种快速检测试剂质量事故,试剂厂家2（2008年2月1日）事件：X人民医院检验科报告试剂厂家2（胶体金法）批号为2007071801对1份HIV-1抗体阳性的病人样品检测1份呈假阴性反应。结果：将该样品和试剂上送中心实验室复核，结果为该样品对该批号试剂以及另一批号试剂呈阳性反应。原因：试剂检测带的显色太浅造成漏判和误判。,几种快速检测试剂质量事故,试剂厂家3（ 2008年2月23日）事件：X市CDC报告试剂厂家3 （胶体金法）批号为W0680401C对5份HIV抗体确证阳性的病人样品检测5份呈假阴性反应。结果：将该批样品和试剂上送中心实验室复核，结果为该样品对该批号试剂反应呈阳性反应。原因：试剂检测带的显色太浅造成漏判和误判。,几种快速检测试剂质量事故,试剂厂家4 （ 2009年4月10日）事件：X确证实验室报告试剂厂家4（金标法）批号为W0690305C对10份HIV抗体阴性的病人样品检测5份呈假阳性反应。结果：退货并更换新批号试剂。,快速检测注意事项,不提倡个人在家中检测。应由经培训的人员操作，注意生物安全操作，避免职业暴露发生。在质控窗口内出现质控带，如实验完成后未呈现红色质控带，说明试剂盒内质控无效，该试验结果无效，样品须重检。出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在单包装内存在混杂物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊 （特别是产品名称或出产厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期）；缺失目录；泄漏或污染；不适宜的存放条件；保护包装纸破损或污染；,HIV检测后阴性结果咨询的程序和内容,1.核对求询者的编号和结果，确保检测结果的准确性。2.直接向求询者告知检测结果，解释检测阴性结果的意义。3.讨论窗口期问题：核实本次检测是否处于窗口期内，4.帮助求询者制定改变个人危险行为的计划,讨论安全性行为