2013免疫学与临床诊断基础

免疫学与临床诊断基础,管宝全 北京热景生物,2,2,目 录,免疫学基本概念抗原抗体结合反应的特点及影响因素免疫学在临床诊断上的基本应用,3,3,1、免疫学基本概念,免疫抗原抗体,4,免疫（Immunity）,机体识别“自我”与“非自我”的过程。通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。,免除瘟疫,5,免疫的功能,抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物侵袭的能力，又称免疫防御。 当该功能过于亢进，发生超敏反应；当该功能过于低下，发生免疫缺陷病。 （抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫）自身稳定（Homeostasis）：清除机体在新陈代谢过程中产生的大量衰老死亡细胞，维持机体的生理平衡。该功能异常时，发生自身免疫病。免疫监视（Immunological surveillance）：识别、清除因物理、化学和病毒等生物因素的影响而发生癌变的机体细胞。当这一功能低下或失调时，会导致肿瘤或癌症。,6,7,抗原,抗原：凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反应的物质。构成抗原的条件1. 异物性：只有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱，眼球晶体蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白大分子性：一般在10 kD以上，分子量越大，抗原性越强 。 3. 具有复杂的立体结构或空间构象.如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差,8,抗原的特性,免疫原性：抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的性能，即诱导免疫应答的能力抗原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞发生反应的性能，也称反应原性完全抗原与半抗原具备免疫原性和反应原性两种能力的物质称为完全抗原，如病原体、异种动物血清等。只具有反应原性而没有免疫原性的物质，称为半抗原，如青霉素、磺胺等。半抗原没有免疫原性，不会引起免疫反应。但在某些特殊情况下，如果半抗原和大分子蛋白质结合以后，就获得了免疫原性而变成完全抗原，也就可以刺激免疫系统产生抗体和效应细胞。,9,抗原决定簇（表位）,一般抗原决定簇是由612氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来线性或连续决定簇；构象或不连续决定簇抗原决定簇（B细胞）；免疫原性决定簇（T细胞）功能性决定簇；隐藏性决定簇,抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活性的化学基团,是抗原与抗体结合的部位，决定抗原特异性。,10,抗原决定簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础,抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。即淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。抗原也是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应的。,11,抗体,抗原刺激B淋巴细胞, 使之增殖分化成浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。,12,免疫球蛋白,免疫球蛋白：在人和动物血液、组织液及其他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白（Ig）。,13,抗体的功能,免疫球蛋白的功能与抗原结合激活补体组织结合调理作用抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC）免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体( Ab1 )； 同时又可引起机体产生抗体（抗抗体,Ab2 ），所以既是抗体又是抗原,14,抗体与抗原结合,抗体的主要功能是与抗原（包括外来的和自身的）相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物。每种抗体与特定的抗原决定基结合。这种结合可以使抗原失活，也可能无效但有时也会对机体造成病理性损害，如自身抗体的产生，对人体可造成危害。,15,抗体与补体结合,（1）增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性； （2）增加血管的通透性； （3）中和病毒； （4）细胞溶解作用； （5）免疫反应的调节作用等。,补体可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用,16,抗体的制备,抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清。多克隆抗体 (PAb)：多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物。单克隆抗体（MAb） ：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。,17,17,2、抗原-抗体反应的特点,反应原理三大特点影响因素,18,抗原抗体反应原理,抗原的抗原决定簇与抗体的结合部位之间的结构具有互补性，二者相互结合后，在适宜条件下，可出现可见反应。因此，抗原抗体反应是指抗原与相对应的抗体之间所发生的特异性结合的反应。反应可分为两个阶段，第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的反应阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二阶段为可见反应阶段，即抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体等）的影响下，表现为凝集、沉淀、补体结合等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，常需数分钟、数小时或甚至数日。,19,抗原抗体反应的特点1：高度特异性,高度特异性指一种抗原只能与由它刺激所产生的抗体结合的专一性。它是免疫学诊断的重要基础。亲和力(affinity)：抗体分子上一个抗原结合部位与相应抗原决定簇之间的结合强度。亲合力(avidity): 一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。 抗原抗体的结合实质上是抗原决定簇与抗体超变区之间的结合，由于两者在化学结构和构型上呈互补关系，所以结合具有高度特异性。由于抗原成分复杂，常含有多种抗原决定簇，如果两种不同抗原分子上有相同的抗原决定簇或抗原、抗体之间构型部分相同皆可出现交叉反应。,20,特异性,抗原A,抗原C,抗原B,特异性反应,交叉反应,无反应,21,抗原抗体反应的特点2：可逆性,在一定条件下抗原抗体复合物这一反应是可逆的。抗原抗体复合物解离的程度与两者的亲和力有关。亲和力与抗体结合价相关，是抗体功能结合力抗原抗体之间的结合主要是分子表面的非共价键结合，稳定，但在适当条件（如低pH、高浓度盐、冻融等）下可解离开，各自的生物学特性不发生改变。根据此特点，可利用亲合层析法纯化抗原或抗体。,22,可逆性,K（亲和常数）=,Ag+Ab,Ag Ab,23,抗原抗体反应的特点3：浓度比率适宜性,抗原、抗体比例适合时，在适宜的盐浓度下可形成肉眼可见的反应物（凝集物或沉淀物）。在沉淀反应和凝集反应中抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，只有在抗原抗体只有在最适比例时才出现肉眼可见的沉淀物。网络学说大多数抗体是两价的，而抗原是多价的。当抗原与抗体处于等价带时，可互相结成为具有立体结构的巨大网络状聚合体，形成肉眼可见的沉淀物。但当抗原或抗体过量时，由于结合价不能相互饱和就只能形成较小的沉淀物或可溶性抗原抗体复合物。,24,适合比例性,抗体含量,抗原含量,前带,后带,等价带,以定量抗原检测抗体，若抗体过剩，可使所形成的免疫复合物反而减少，而不出现凝集。,以定量抗体检测抗原，若抗原过剩，可使所形成的免疫复合物反而减少，而不出现凝集。,25,抗原抗体反应的影响因素,温度：适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会， 加快二者结合速度。不宜过高过低。电解质：可使IC复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应。常用生理盐水稀释抗原或抗体。而抗原抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。酸碱度：最适pH68，否则可出现假阴或假阳性结果抗原和抗体性质：抗体的特异性和亲和力是关键，初次应答抗体亲和力低，单克隆抗体亲和力低；抗原理化性质、抗原表位多寡等。,26,26,3、免疫学在临床诊断上的基本应用,概论分类趋势,27,免疫学诊断概论,免疫学诊断：用免疫学检测技术确定疾病相关因子、监测疾病过程、判断疗效及预后，涉及对疾病相关因子的诊断和辅助诊断，以及检测机体免疫功能状态。应用范围疾病诊断：感染性疾病、免疫缺陷病、自身免疫病、超敏反应性疾病、肿瘤免疫监测：辅助诊断、疗效判断、病情分析、预后判断,28,免疫学检测的分析学表现,准确性精密度灵敏度特异性,检测线性范围试剂稳定性定标周期开瓶效期,29,免疫学检测的分析学表现,临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:,理想状态,健康人群,疾病人群,灵敏度 100%特异性 60%,特异性 100%灵敏度 50%,灵敏度增加 特异性增加,假阴性 假阳性Cut-off,设置cutoff值在此处用于筛查分析,设置cutoff值在此处减少错误诊断带来的高花费,设置cutoff值在此处为了最少化错误结果,30,免疫学检测技术分类,根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分不同，可将检测抗原抗体反应分为：凝集反应沉淀反应补体结合反应标记免疫反应,31,凝集反应（agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在适宜电解质下形成肉眼可见凝集物的反应。直接凝集：玻片和试管凝集间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集间接凝集抑制试验：,32,33,沉淀反应（precipitation),血清蛋白质、细菌裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后，在有电解质存在时，出现肉眼可见的沉淀物的反应。,34,1 单向免疫扩散 (single immunodiffusion)（1）特点：定性定量试验。以数值计算为基础的单向辐射状免疫扩散试验。常用于抗原定量。（2）用途：可用于测定血清IgG,IgM,IgA和C3等的含量（3）原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关。（4）操作：铺板 = 打孔=加样=放湿盒 =看结果。,35,36,2 双向免疫扩散(double immunodiffusion)（1）特点：定性半定量。分析鉴定抗原、抗体纯度和抗原特异性的试验。即抗原和抗体分子在凝胶板上扩散，二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线。（2）用途：用于抗原或抗体的定性检测、组成和多抗原相关性分析。（3）操作：铺板=打孔 =加样=放湿盒 =看结果。3 对流免疫电泳试验 其实质是将双扩与电泳相结合，又叫反向免疫电泳或免疫电渗电泳。（1）特点：定性试验。将琼脂内电泳和凝胶内沉淀反应相结合。比琼脂扩散法的灵敏度要高1016倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。（2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性检测。（3）操作：铺板=打孔 =加样 =电泳 =看结果。,37,38,4 免疫电泳 （immunoelectrophoresis) 也是将电泳技术与双向免疫扩散结合的一种技术，先电泳后双向免疫扩散 。,39,5 免疫比浊 （immunoephelometry） 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成IC，液体浑浊，用浊度计测反应体系的浊度，据标准曲线推算样品中抗原含量。,40,补体结合反应,可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。补体结合反应是诊断人、畜传染病常用的血清学诊断方法之一。本法不仅可用于诊断传染病，如鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、血锥虫病等，也可用于鉴定病原体，如对马流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。,41,试验由两个阶段组成：首先将经过56处理30分钟使补体灭活的抗血清，与抗原及补体（通常将豚鼠血清作适当稀释后使用）混合使起反应。第二是加入已同抗绵羊红细胞抗体相结合的绵羊红细胞（致敏红细胞）。利用抗原抗体复合物同补体结合，把含有已知浓度的补体反应液中的补体消耗掉使浓度减低的现象，以检出抗原或抗体的试验在最初阶段对消耗补体建立起足够的抗原抗体反应时，没有发生致敏红细胞的溶血，但补体剩余下来则引起溶血反应。用于检查梅毒的梅毒补体结合反应（瓦氏反应，Wassermann reaction）是最常进行的补体结合试验。补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的比例。特别是补体和溶血素的用量。,42,免疫标记技术,用荧光素、酶、放射性核素等标记抗原或抗体后进行抗原抗体反应。提高检测灵敏度、快速、可定性、定量，定位等。,1、荧光免疫技术2、酶免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术,43,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,44,免疫荧光技术(Immunofluorescence technique，IF),45,荧光抗体技术基本原理,将荧光素以化学方法与特异抗体共价键牢固结合（此荧光抗体，既保留原有的特异反应，又显示荧光），使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，洗涤除去游离的荧光抗体后，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性、直观性结合，可对标本中的抗原进行鉴定和定位。用途：可用于检查细菌、病毒、螺旋体等的抗原或抗体，帮助诊断传染病；也可用于鉴定免疫细胞的CD分子，检测AID的抗核抗体等。,46,47,常用的荧光素,异硫氰酸荧光素：FITC，黄绿色荧光四乙基罗丹明：RB200，橘红色荧光四甲基异硫氰酸罗丹明：TRITC，橙红色荧光藻红蛋白：PE多甲藻叶绿素蛋白：PerCP标记方法：搅拌法(适合大样品) 透析法(适合小样品)标记抗体的纯化：透析法、层析分离法,48,（一） 直接法 用特异荧光抗体直接滴加于待检抗原标本上，由于标记抗体与抗原发生特异结合，使之呈荧光，根据荧光分布和形态确定抗原性和部位。缺点是每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。（二） 间接法 间接法可用于检测抗原和抗体。抗原或标本加上抗体或标本（第一抗体）混合后，加荧光抗体（第二抗体）。在荧光显微镜下检测荧光分布。本法灵敏度高，可对多种抗原进行试验。敏感性比直接法高，制备一种荧光二抗可用于多种抗原的检查，但非特异性增多。（三） 补体结合法补体结合法是间接法的一种改良，在抗原抗体反应时加入补体，再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。,49,（四） 双标记法采用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，进行同一标本的荧光染色，若有相应的两种抗原存在便同时见到两种（橙红、黄绿）荧光。为均相荧光免疫测定的一种类型，检测试剂为FITC标记的抗原和罗丹明标记的抗体，当两种标记物标记的抗原和抗体特异性结合后使两种荧光素靠近，由于FITC的发射光谱能被罗丹明吸收，从而使FITC的荧光明显减弱。试验时将可能含有抗原的标本与两种标记物一起反应，则能与FITC标记的抗原竞争结合罗丹明标记的抗体，从而减少罗丹明对FITC发射光谱的吸收。通过FITC荧光测定可推算出标本中抗原的量，其与荧光强度成正比。,50,优点：操作简便、特异性高、非特异荧光染色因素少。缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。,优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。,51,直接法,间接法,补体法,双标记法,52,在医学检验中主要用于：1. B和T细胞及亚群的鉴定；2. 自身抗体检测；3. 组织中免疫球蛋白及补体组分检测；4. 特异的组织固定抗体检测；5. 微生物的快速鉴定；6. 特殊染色体的鉴定；7. 肿瘤特异性抗原的检测；8. 移植抗原鉴定；9. 激素和酶的局部组织定位。,荧光抗体的发展应用 荧光抗体技术目前正朝定量、自动化方向发展。用流式细胞仪和显微荧光光度计直接测定单个细胞经荧光抗体着色后的荧光强度。,53,放射免疫技术,酶免疫技术,发光免疫技术,三大经典标记技术,54,放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA),55,基本原理,应用放射性同位素标记的抗原，通过免疫反应测定样本中抗原的技术标记抗原Ag*和非标记抗原Ag对特异性抗体Ab的竞争结合反应。反应式为：,在这一反应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量都是固定微量的，而受检的非标记抗原量是不固定的,用于制备标记抗原的抗原必须是高纯度的。,56,结合相,游离相,标记抗原（固定微量）,抗体（固定微量）,抗体（固定微量）,标记抗原（固定微量）,非标记抗原（被测物）,57,常见RIA标记物,1、常用的放射性同位素有两大类：射线： 131I、125I、57Cr和60Co射线：14C、3H和32P2、使用最广泛的是：125I性质活泼、易制备标记物对被标记物的免疫活性影响小测量方法简便、已推广半衰期较长、核素丰度高,液闪仪,计数器,58,特点分析,优势：将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结合；敏感度可达ng-pg水平；较宽的检测线性范围局限：标记物的半衰期短；试剂效期短；检测结果的重现性差；每次检测都要做标准曲线；分析的反应时间长，半天-2天；发射性污染有害；很难实现自动化检测；竞争性反应为相对值而非绝对值（部分参加反应）应用：常用于检测激素类和肿瘤标志物等微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、吗啡、AFP、CEA、PSA等。（1959年由Yalow和Berson首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量的测定）趋势：现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，但无法完全取代RIA,59,酶免疫技术(enzymeimmunoassay,EIA),60,酶免疫技术,将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合。敏感度可达1ug/L,甚至1ng/L。常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。常用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）测定可溶性抗原或抗体，用酶免疫组化法测定组织中或细胞表面的抗原。酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶联接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。,61,均相型（homogenous）,非均相型（heterogeneous）,酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。,62,间接法,检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。,63,夹心法,双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,64,竞争法,竞争法要用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比,65,66,化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),67,发光,光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，发射光子释放出能量,物质电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后从电子激发态返回基态，伴随能量释放，表现为光子的发射,68,化学发光,化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，可以分为直接发光和间接发光。化学发光反应的发光类型通常分为闪光型（flash type）和辉光型（glow type）两种。闪光型发光时间很短，只有零点几秒到几秒。辉光型又称持续型，发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久。闪光型的样品必须立即测量，必须配以全自动化的加样及测量仪器。辉光型样品的测量可以使用通用型仪器，也可以配有全自动化仪器。,69,直接化学发光,一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C h其中为光子，C*表示C处于单线激发态。,直接发光是最简单的化学发光反应，有两个关键步骤组成：即激发和辐射。如A、B两种物质发生化学反应生成C物质，反应释放的能量被C物质的分子吸收并跃迁至激发态C*，处于激发的C*在回到基态的过程中产生光辐射。这里C*是发光体，此过程中由于C直接参与反应，故称直接化学发光。,70,间接化学发光,若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h,间接发光又称能量转移化学发光，它主要由三个步骤组成：首先反应物A和B反应生成激发态中间体C*(能量给予体)；当C*分解时释放出能量转移给D(能量接受体)，使D被激发而跃迁至激发态D*；最后，当D*跃迁回基态时，产生发光。,71,发光底物,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。能作为发光底物的条件： 发光的量子产率高； 它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配； 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果； 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。,72,直接化学发光剂,直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,73,1. 吖啶酯,在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。,74,2三联吡啶钌,三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。,75,电化学发光剂反应原理,76,酶促反应发光剂,利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂,77,鲁米诺,78,AMPPD,3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷,79,化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析仪包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。,80,直接化学发光免疫分析,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,81,直接化学发光免疫分析原理,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,- 夹心法,（1）加入H2O2（pH10）,82,化学发光酶免疫分析CLEIA,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay）是用参与催化某一化学发光反应的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数