骨代谢研究进展

骨代谢研究的最新进展,天津医科大学总医院内分泌科 邱明才,前 言,骨组织时刻处于骨重建的动态变化之中，即不间断的骨形成、骨吸收贯穿生命的始终。骨重建的范围非常广泛，几乎每10年成人骨骼完全再生一次。对于健康青年人，骨形成量与骨吸收量保持动态平衡。随着年龄增长，骨吸收日益占据优势，由此可导致骨质疏松等衰老性疾病的发生。,骨重建的过程有赖于两大类细胞的活性：其一是成骨细胞，负责生成新骨（骨形成）； 其二是破骨细胞，负责破坏旧骨（骨吸收）。 成骨细胞和破骨细胞的功能存在紧密联系，成骨细胞系通过合成、分泌某些物质，继而启动和调控破骨细胞分化。,骨代谢研究中的主要问题就是研究成骨细胞和破骨细胞分化和活性的调控机理，以期实现骨重建的动态平衡，达到预防和治疗各种代谢性骨病的目的。,骨重建的调控机理极其复杂，但尽管如此，由于人们的不懈努力，骨代谢研究领域不断有令人兴奋的发现。其中，瘦素(Leptin)与骨保护素(Osteoprotegerin, OPG)是近几年发现的两个非常值得重视的生物活性物质，骨代谢研究也因之取得了突破性进展。,一、瘦素与骨形成,（一）瘦素简介,瘦素是由LEP基因（位于人类染色体7-q32）编码的一种由167 个氨基酸组成的分泌型蛋白质，分子量约为14-16kDa。它主要由白色脂肪组织产生，棕色脂肪、骨骼肌、胃粘膜、胎盘、胎儿的心脏、骨、软骨组织等均可分泌瘦素。,白色脂肪组织分泌瘦素与体内脂肪含量成正比，但受多种因素调节，如胰岛素和糖皮质激素可促进其分泌，禁食和受体阻滞剂可抑制分泌，交感神经系统通过3 肾上腺能受体发挥主要的正性调节作用。骨骼肌与胃粘膜分泌瘦素与进食和体内营养状态关系密切。,瘦素主要受体重调节:,瘦素进入血循环后或处于游离状态，或与瘦素结合蛋白结合，最后通过位于脉络丛的瘦素受体转运至脑脊液中。 瘦素受体属于I类细胞因子受体， 目前认为至少有五种同分异构体，其中最重要的是在下丘脑表达的长型瘦素受体。 瘦素与下丘脑的长型瘦素受体结合后通过双向激活激酶(JAK)或信号传导和转录激活蛋白(STAT) 途径传递信息，影响神经肽等多种神经内分泌激素分泌。,瘦素的生理功能包括：感受机体的营养状态,进而抑制食物摄入；刺激或维持能量消耗；影响生殖内分泌系统；作为一种代谢激素促进一系列代谢过程，如胰岛素释放、脂解作用、糖的转运等。,最新研究发现， 瘦素可促进天然细胞和记忆细胞的增殖反应， 促进TH1 型细胞因子，抑制TH2型细胞因子产生。 所以，人们普遍认为瘦素与饥饿状态下的免疫功能抑制有关。瘦素缺乏或瘦素受体缺陷可导致肥胖和垂体功能异常。,研究表明，肾脏是清除瘦素的主要器官。瘦素首先以原型形式从肾小球滤过，继而肾小管摄取原尿中的瘦素并降解并随尿排出。各种肾脏疾病造成的肾小球滤过功能或肾小管功能损伤可影响瘦素从体内的清除，导致瘦素在体内的聚积，进而对机体造成各种不利影响。,（二）瘦素对骨形成的调节作用,1.瘦素抑制骨形成的生物学效应,由瘦素信号系统异常导致的垂体功能异常常合并性腺机能减退。从传统意义上讲，性腺机能减退通常可导致骨量丢失。然而，人们却惊奇地发现，瘦素基因缺陷的小鼠(ob/ob)和瘦素受体基因缺陷的小鼠(db/db)均有高出野生型小鼠23倍的骨总量；而且随着年龄增加，骨量改变日趋明显。,迄今为止，ob/ob小鼠和db/db小鼠是唯一已知的既有性腺机能低下又有骨总量增加的动物模型。这两种动物模型对于研究骨重建的分子基础具有极高的价值。这些突变小鼠的骨量改变与瘦素信号系统缺陷导致的高胰岛素血症无关，杂合体小鼠没有高胰岛素血症但仍有骨总量增加。,2.瘦素抑制骨形成的作用机理,骨形态计量学分析发现，瘦素通过对成骨细胞的作用而抑制骨形成；瘦素对破骨细胞的分化和功能没有明显影响。,一个非常重要的发现是，ob/ob小鼠和db/db小鼠成骨细胞数量正常。由此可见瘦素对成骨细胞的分化没有影响。如果瘦素对骨有局部作用，那么瘦素肯定是影响已分化的成骨细胞，而不是其祖细胞。 但是，已分化的成骨细胞表面没有发现瘦素受体表达；就这一点而言，db/db 小鼠与野生型小鼠的成骨细胞培养研究没有发现显著不同。这些数据表明，瘦素不是直接作用于成骨细胞。,进一步研究发现，ob/ob小鼠脑室内注射瘦素可完全逆转骨量改变。 由于脑室内注射不影响瘦素的血浆浓度，该项研究可证实瘦素通过中枢神经系统调控骨形成，作用的部位很可能在下丘脑。野生型小鼠脑室内注射瘦素可导致骨量丢失，更表明了瘦素对骨量的中枢性调节是生理性的。由此推论，如果说瘦素介导的下丘脑或神经中枢的生理性调控参与骨重建过程，那么诸如骨质疏松等代谢性骨病也存在瘦素介导的中枢性调控。,瘦素作用机理示意图,Osteoblast maturation and hypothalamic regulation of bone formation. (a) Ihh (Indian hedgehog) and Cbfa1 are the only genes known to control the maturation of osteoblasts from mesenchymal cells. Cbfa1 is also involved in osteoblast function. (b) Leptin inhibits bone formation through the hypothalamus. The hypothalamus represents a relay between the control of bone formation, body weight and gonadal function. Abbreviation: Cbfa1, core-binding factor 1; Ihh, Indian hedgehog.,(三)瘦素对骨形成进行中枢性调控的重要临床意义,瘦素对骨形成的调节不仅限于小鼠。瘦素信号系统缺陷的大鼠也表现为骨量增加。脂肪细胞和白色脂肪几乎完全缺如的广泛性脂肪营养不良的病人可表现为骨硬化（骨形成增加）和骨生长加速。瘦素基因缺陷的病人是否有骨量增加不易观察，因为这类患者将早期接受瘦素治疗。然而有一点早已为人们所认识，即肥胖患者不易发生骨量减少性疾病，其原因可能与肥胖患者多伴有瘦素抵抗有关。,由上可见，瘦素抑制骨形成作用机理的阐明使得人们对骨质疏松等代谢骨病的病因有了崭新的认识。据此笔者曾一度认为，抑制瘦素合成和促进瘦素从体内清除以降低血浆瘦素水平可能成为骨质疏松等代谢性骨病的有效治疗手段。,但是最新研究发现，绝经后妇女血浆瘦素水平与骨总量没有直接联系。这一发现提示，瘦素的敏感性和生物效应增强在骨质疏松的发病过程中更为重要，拮抗瘦素的生物活性而不是一味追求降低血浆瘦素水平应当是骨质疏松治疗的主要研究方向。,二、骨保护素与骨吸收,（一）骨保护素简介,骨保护素属分泌型糖蛋白，为肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)，又称破骨细胞形成抑制因子(OCIF)。骨保护素在体内以单体和同源二聚体两种形式存在。人、小鼠和大鼠的骨保护素前肽含401个氨基酸残基，翻译后加工时氨基端含21个氨基酸残基的信号肽被去除，成熟的骨保护素含380个氨基酸残基。,骨保护素分子含有7个功能区( D1D7) ：端的D1D4 结构上与肿瘤坏死因子受体超家族的其它蛋白质的细胞外区相似，参与配体的结合，与抑制破骨细胞的作用直接相关；靠近端的D5、D6为死亡结构域同源区，介导细胞毒性作用；D7具有一个肝素结合位点，该位点的肝素亲和力与骨保护素 对破骨细胞的抑制作用无关；D7还有一个半胱氨酸残基(Cys379)，负责同源二聚体的二硫键形成。,D7的半胱氨酸被丝氨酸取代，导致无法形成同源二聚体，使得部分骨保护素以单体形成存在。 两种形式的骨保护素在稳定性、唾液酸含量、和抑制破骨细胞形成的特异活性方面无区别，但同源二聚体形式的骨保护素与肝素的亲和力强、 初始半衰期短、降低大鼠血清钙浓度的生物学活性高。,体内多种组织器官可分泌骨保护素，对成年人而言，心、肺、肾和骨组织合成骨保护素较多，其它还可合成骨保护素的组织包括胎盘、肝脏、甲状腺、脊髓、脑、免疫和造血组织等。体外培养条件下可高表达骨保护素的细胞类型包括：成骨细胞、内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和多种肿瘤细胞株等。,骨保护素分泌的调节,（二）骨保护素对骨吸收的抑制作用,1. 骨保护素抑制骨吸收的生物学效应,遗传学模型研究发现： (1)过度表达骨保护素的转基因小鼠表现为早期、进行性大理石样骨病，病变累及长骨、脊椎骨和骨盆等多个部位。与其它类型的大理石样骨病动物模型不同，这些转基因小鼠除有代偿性髓外造血导致的脾大外，无其它骨骼和骨外组织异常表现。,组织学观察，这些小鼠的矿化小梁骨普遍增加，骨髓腔变小； 最有意义的发现是，小梁骨破骨细胞数量显著增加，而单核巨噬细胞系的其它造血细胞数目均正常，表明骨保护素的过度表达主要通过抑制破骨细胞分化的终末阶段来增加骨总量。,(2)敲除骨保护素基因的小鼠早期发生严重的骨质疏松，表现为骨矿密度显著降低，股骨和骨盆皮质骨变薄，股骨生长板损伤和多发性骨折。此外，这些小鼠常伴有大动脉钙化，主要累及主动脉和肾动脉的血管中层。,组织学观察，小鼠出生后2月小梁骨几乎完全缺如；骨皮质血管数量增加，周围聚集着大量的破骨细胞和成骨细胞。骨计量学研究发现，这些小鼠骨吸收和骨形成均显著增加，高于野生型小鼠的4倍，血清碱性磷酸酶水平则增加得更多。,应用外源性骨保护素进行研究亦证实了骨保护素抑制骨吸收的作用。体外研究表明，骨保护素的主要作用包括抑制破骨细胞形成的终末阶段、抑制破骨细胞活性和促进破骨细胞凋亡。体内应用骨保护素可显著抑制生理、病理情况下的骨吸收，表现为骨矿密度和小梁骨量的明显增加。,2. 骨保护素抑制骨吸收的作用机理,(1) 骨保护素配体(OPG ligand, OPGL)：OPGL又称作 破骨细胞分化因子(Osteoclast differentiation factor,ODF) 肿瘤坏死因子相关性活化诱导因子(TRANCE) NF-受体激活物配体(RANKL)OPGL 为肿瘤坏死因子受体配体超家族成员11(TNFSF11)，由317个氨基酸残基组成，属II型跨膜蛋白，在体内以细胞结合型和可溶性羰基末端两种形式存在，两种类型均可被骨保护素结合而失去生物活性。,OPGL 在淋巴组织（淋巴结、胸腺、脾）和小梁骨高度表达，其次是骨髓组织。直接参与骨代谢的OPGL由成骨细胞分泌，通过旁分泌方式发挥作用。OPGL的主要作用机理是与成熟破骨细胞及其祖细胞膜表面的另一种肿瘤坏死因子受体超家族成员11A(TNFRSF11A，又称为NF-受体激活物，RANK) 结合，直接促进成熟破骨细胞活化以及破骨细胞的生成。,OPGL在破骨细胞的生成和激活过程中是不可或缺的，这是因为：OPGL和巨噬细胞集落刺激因子( M-CSF)是目前已知的破骨细胞生成过程中唯一必需的两种细胞因子；促进破骨细胞激活的多种生物活性物质，包括各种激素类物质、细胞因子和前列腺素等，均通过促进成骨细胞分泌OPGL而激活破骨细胞；敲除OPGL基因的小鼠表现为严重的大理石样骨病和出牙障碍，同时伴有T、B淋巴细胞的早期分化障碍，全身淋巴结缺如，而脾脏结构和淋巴集结形成、树状细胞功能正常。,(2)目前已阐明的骨保护素三条作用途径：骨保护素的最主要作用是与OPGL结合，拮抗RANK 与OPGL的结合，进而抑制破骨细胞的分化和活性。RANK是破骨细胞表面介导OPGL生物活性的唯一受体，而骨保护素则是OPGL 特异性抑制物。破骨细胞细胞膜上存在一种分子量为140kDa的蛋白质，骨保护素可以与该蛋白特异结合直接抑制破骨细胞功能。这一过程没有OPGL及其受体RANK的参与。通过干扰基质细胞与破骨细胞之间的相互作用，诱导破骨细胞凋亡。骨保护素的D5、D6两个死亡结构同源区与诱导破骨细胞凋亡的作用有关，去除D5、D6后，骨保护素诱导破骨细胞凋亡的活性明显降低。,骨保护素及其配体对破骨细胞作用图例,（三）骨保护素抑制骨吸收的重要临床意义,大量研究表明，骨保护素对于治疗多种代谢性骨病可能有效，当前研究最多的是将其用于骨质疏松的治疗。在体外培养条件下，雌激素可使成骨细胞株分泌骨保护素增加34倍， 提示绝经后雌激素水平下降进而影响骨保护素分泌与绝经后骨质疏松的发生有关。Bekker PJ等临床研究第一次证实了单剂骨保护素可快速、有效地抑制骨转化，对于治疗绝经后骨质疏松具有重要临床意义。试验中未发现严重副作用和实验室检查异常，仅个别病人有注射部位的局部瘙痒，血尿钙轻度降低、血清PTH增高。,另有研究发现，骨髓细胞合成骨保护素的能力随着年龄增长而下降；短期应用糖皮质激素即可显著降低血清骨保护素水平。这些研究提示骨保护素对于治疗老年性骨质疏松和药物性骨质疏松亦可能有效。,在免疫性骨关节损害过程中，OPGL的全身性表达和局部表达均增加。抗原刺激可系统性激活T淋巴细胞，促进其分泌OPGL。应用骨保护素抑制OPGL 的生物活性已成为免疫性骨关节疾病治疗的又一新思路。动物试验已经表明，佐剂性关节炎的模型大鼠用骨保护素治疗可以预防或减轻骨和软骨损害。,另有研究证实，骨保护素可使恶性肿瘤并发体液性高钙血症的小鼠血钙迅速下降。,可见，骨保护素/OPGL 是骨代谢研究中的又一个里程碑式发现。在不久的将来，