组织培养课程感想.doc

植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。外植体：愈伤组织：一、植物组织的主要特征：（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入； （3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。 1、根据培养材料不同分为： （1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。 （2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。 （3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。 （4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。 （5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。 （6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。 三植物组培的应用1.植物离体快繁。2.无病毒苗木培养。3.培育新品种或创制新物种。4.次生代谢物生产。5.植物种质资源的离体保存。6.人工种子。1.）实验室包括：准备室，无菌操作室，培养室，温室。2.）器具的灭菌：1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。 （1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 保温2小时，成本较高。 （2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 1520分钟 。 （3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。120 1520分钟。培养基体积越大，灭菌时间越长。3、不耐高温化合物：采用过滤灭菌，如IAA等。4、外植体的表面灭菌： 采用7075乙醇（10-30秒）、有效氯1的次氯酸钠（5-30分钟）、0.10.2%的氯化汞（2-15分钟）等。杀菌剂中加入几滴吐温20或80（Tween20或80）效果较好。3）无菌操作： 1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理，进行消毒。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。 2、保持超净工作台的洁净：接种前用70乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌后清洗，以减少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。 4）通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5 mmol/l的元素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S，微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等有机成分、主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量101000mg/L, 通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。植物生长调节剂、常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：1、生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D 2、细胞分裂类：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip3、赤霉素类：GA3、GA4、GA7 4、脱落酸：ABA 5、乙烯：ETH碳源、 碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在25，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。琼脂以及其他附加物等。琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在410g/L. 琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80。5）培养基的具体步骤：取出母液并按顺序放好，将有机营养物质贮液融化待用；取一只烧杯，放入三分之一左右纯水，将母液按顺序加入并不断搅拌；加入植物生长调节剂和蔗糖，待糖溶解后定容；将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂，并加热视其溶解；调ph；分装封瓶；灭菌；冷却取出待用。1）植物细胞的全能性（Totipotency）即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。 2）分化（differentiation）：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。3）脱分化（Dedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。4）植物胚胎发生：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。1）植物离体培养中再生植株有哪些途径？根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。（还有先根后芽，先愈伤再根芽）离体培养中再生植株的主要途径有：器官发生；器官型（直接由外植体的细胞形成器官原基），器官发生型（外植体先形成愈伤组织，再产生器官原基）胚胎发生（与合子胚的发生过程类似，体细胞胚在形态和生化水平上和合子胚都相似。）2）愈伤组织是如何形成与生长的？在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织， 细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。3） 植物体细胞胚胎发生有哪些途径？直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。通常包括2个阶段：（1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。（2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。4）影响植物离体形态发生的因素有哪些？一、植物种类和基因型1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。2、同一物种不同基因型间存在较大差别。二、培养材料的生理状态1、发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高；2、培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好；3、培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。三、 培养基1、营养成分 一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。 茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。 茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。 碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。2. 植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用）（1）生长素：促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。2，4 D诱导体细胞胚胎发生。（2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。（3）赤霉素：GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。（4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用（5）脱落酸：对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。3、培养基的性质（1）愈伤组织诱导：在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏）。（2）细胞和胚状体的诱导：在液体培养基上。（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：渗透压，要求高.四、培养条件1、光照培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。