SDS-PAGE蛋白电泳手册.doc

. 蛋白电泳手册SDS-PAGE及Westernblot蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100g)，分辨率高，凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。SDS-PAGE原理SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDSPAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者*，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDSPAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。索引蛋白电泳（SDS-PAGE）电泳试剂总表制胶上样及电泳染色蛋白提取蛋白定量Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准（图）考马斯蛋白胶快速染色液WesternblotWesternblottingDAB检测试剂盒WesternblottingECL化学发光检测试剂盒Westernblotting试剂盒使用说明蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换）系号货号名称1T8060TRIS三羟甲基氨基甲烷2G8200Glycine甘氨酸3S8010SDS十二烷基硫酸钠4A8080Acrylamide丙烯酰胺5M8200N,N-MethyleneBisacrylamide甲叉双丙烯酰胺6A8090AmmoniumPersulfate过硫酸胺7D8220DTT二硫苏糖醇8M8210-Mercaptoethanol-*9T8090TEMED四甲基*10A101030%丙烯酰胺（29:1）11S10514XSDS-PAGE分离胶缓冲液（PH=8.8）12S10524XSDS-PAGE浓缩胶缓冲液（PH=6.8）13P10164蛋白上样缓冲液(含-*)14P10154蛋白上样缓冲液(含DTT)15D10701MDTT16A103010%过硫酸氨17T10201MTris-HCL(PH6.8)18T10101.5MTris-HCL(PH8.8)19S101010%SDS20T10705Tris-甘氨酸电泳缓冲液SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、2、3、4、5、6、7、8、9全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、13/14、16、9、20。还可选择10、13/14、16、9、17、18、19、20。一，制胶凝胶配制表（一）分离胶12%分离胶10%分离胶8%浓缩胶（3%）总体积10ml10ml10ml5ml4X分离胶缓冲液（PH8.8）2.5ml2.5ml2.5ml04X浓缩胶缓冲液（PH6.8）0001.2530%丙烯酰胺(29:1)4ml3.32.70.5ddH2O3.4ml4.1ml4.7ml3.2ml10%过硫酸铵100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul凝胶配制表（二）分离胶12%分离胶10%分离胶8%浓缩胶（3%）总体积10ml10ml10ml5ml30%丙烯酰胺(29:1)4ml3.3ml2.7ml0.5ml1MTris-HCL(PH6.8)0000.625ml1.5MTris-HCL(PH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml010%SDS100ul100ul100ul50ulddH2O3.3ml4.0ml4.6ml3.75ml10%过硫酸铵100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul常规SDS-PAGRE凝胶可按上表一或者表二配制。TEMED和10%过硫酸铵最后加，在加入前需混匀前面所加试剂。10%过硫酸铵在4有效期为一周，TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。在常温下胶30分钟内可以凝固，如温度过低，可放37温箱凝固。灌完分离胶后，轻轻的加1mlddH2O封上层，胶凝固后可见到分界线。灌浓缩胶时，先倾去水层，再用吸纸吸干。灌浓缩胶后立刻插入梳子。浓缩胶凝固后，放入电泳液中(让电泳液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，可防加样孔变形。配制量可按上表等比加减。如果所用胶浓度与上面不同，可自行调整，主要是加减30%丙烯酰胺的量（需要浓度总体积/30%），最后用水补足总体积。二，上样及电泳取3体积蛋白样品加入1体积4蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴5分钟。冷却后离心取上清上样，一般还在样品的相临孔加上蛋白Marker。上样前将5Tris-甘氨酸电泳缓冲液稀释成1(100ml加入400ml双蒸水混匀)。一般在浓缩胶时电压80V，分离胶时电压120V。在目标蛋白跑到合适的地方，停止电泳。取下胶染色或者再进行下一步实验。注意事项1.SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。2.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。3.有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在*和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。4.有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。5.如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。三，染色蛋白电泳完后，取出电泳玻璃板，小心撬开玻板（一般胶会附在长玻板，即凹玻板一面），用刀片小心切开分离胶与浓缩胶的交界处。丢弃浓缩胶，再用刀在胶左右两边与玻板凸起交界处各画一刀，放入电泳液中，一般胶会自然滑入溶液中。可进行下一步染色。我公司所产蛋白快速染色液，可在半小时内染出结果，详情请见附四（P1300）。附一，蛋白提取货号名称说明R0010高效RIPA组织/细胞裂解液产品简介：在普通RIPA的基础上改进而来,含蛋白酶抑制剂及*酸酶抑制剂(配有一支PMSF).R0020RIPA组织/细胞裂解液RIPA经典配方，适于绝大多数蛋白-蛋白相互作用的免疫实验。组成：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.(配有一支PMSF)保存：4C避光R0030非变性组织/细胞裂解液非变性条件下裂解的蛋白产物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗体结合或酶学活性，因此适宜于进行免疫共沉淀。本系列试剂随同配送一支PMSF，请收到后-20保存。RIPA裂解液4保存，如发现有少量沉淀，可常温放置半小时，沉淀可消失，不影响使用。操作步骤：根据使用量，取每1mlRIPA加入10ulPMSF。使PMSF的最终浓度为1mM。混匀备用（PMSF现用现加）。1，样品前处理：a)对于细胞：贴壁细胞用PBS洗一遍，悬浮细胞直接离心收集，按照6孔板每孔细胞量加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。b)对于组织样品：把组织剪切成细小的碎片。按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量)。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。2，后处理：将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟（对应小离心机为16000转），取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。注：本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合于Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法。附二，蛋白定量蛋白含量测定是以标准蛋白作为对照，根据蛋白浓度不同，吸光值不同而达到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光谱吸收法）来定量，但更多的是用染料对蛋白进行染色，利用染料与蛋白结合显出与原染料及蛋白不同的吸光值来定量的。后一种方法应用更普遍。蛋白定量方法的选择，应该考虑到蛋白结构（标准品选择）、蛋白溶液内干扰物等因素的影响。货号名称组成说明PC0010Bradford蛋白浓度测定试剂盒5G250染色液100ml2-8干扰物质少，Tris、糖、甘油、*、氨、EDTA等均不干扰测定。BSA(5mg/ml)1ml-20CPBS稀释液30ml2-8PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒BCAReagent100ml2-8BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。CuReagent3.0ml2-8BSA(5mg/ml)1ml-20CPBS稀释液30ml2-8PC0030Lowry法蛋白浓度测定试剂盒Folin酚甲试剂A200ml2-8Lowry法测定较为不受脂类物质干扰，适于脂类含量较高的样品测定。也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。Folin酚甲试剂B5ml2-8Folin酚乙试剂20ml2-8BSA(5mg/ml)1ml-20CPBS稀释液30ml2-8附三，蛋白分子量标准（图）附四，考马斯蛋白胶快速染色液(P1300)考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液是一种即用型快速灵敏而且安全的染液，用于SDSPAGE或者非变性胶的快速染色，在半小时内就可以出结果。灵敏度达10ng。使用方法：1.将电泳后的PAGE胶（以8cm10cm大小为例）取下放入容器中，加入50ml双蒸水或去离子水，加热至沸腾后停止，（可选：继续在脱色摇床上摇动5分钟），弃去水溶液。2.加入20ml至25ml快速染色液（按盛胶容器的大小而定，以浸没胶面为准），加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，弃去染色液（此时蛋白条带应已可见）。3.加入约50ml水，加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，换水即可完成脱色，观察结果。注意事项：1染色前的清洗步骤（第一步）中，水的质量非常重要，质量越好灵敏度越高，研究证明，若用自来水加热清洗，染色效果与灵敏度仅与常规甲醇考马斯亮蓝染色（分子克隆第二版）相同。2脱色时可用自来水清洗。3若要得到无背景的染色胶，可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜。4经本产品染色的PAGE胶，胶的缩涨度小于5%，染色后的胶可在水中放置数月而无明显脱色。5每次加热后，继续在脱色摇床上摇动5分钟，可增强染色效果。6本染色液有轻微腐蚀性，请带手套操作。Westernblot经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如*纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或*自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，此技术称为免疫印迹（Westernblot）。Westernblotting检测系统除需要过氧化物酶标记的各种二抗外，还需要配套的显色试剂。索莱宝提供DAB显色和ECL化学发光两种试剂及相应试剂盒。WesternblottingDAB检测试剂盒本试剂盒适合加一抗后的后续显色。操作简单，适合重组等高表达蛋白的检测，其敏感性不如ECL法。编号名称说明SW1010Westernblotting(小鼠IgG)DAB显色试剂盒可配制250ml二抗和100ml显色液，适合一抗为小鼠IgG。SW1020Westernblotting(兔IgG)DAB显色试剂盒可配制250ml二抗和100ml显色液，适合一抗为兔IgG。SW1030Westernblotting(山羊IgG)DAB显色试剂盒可配制250ml二抗和100ml显色液，适合一抗为山羊IgG。SW1040Westernblotting(小鼠/兔IgG)DAB显色试剂盒可配制250ml二抗和100ml显色液，适合一抗为小鼠和兔IgG。试剂盒内容：1.封闭试剂：30g(可配制400ml)脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。2.10倍浓缩抗体稀释液，50ml。3.HRP标记二抗，0.5ml，效价1：500-3000。4.20倍DAB浓缩显色液，5mlA+5mlB。WesternblottingECL化学发光检测试剂盒本试剂盒适合加一抗后的后续显色。敏感性比DAB高10倍。适合组织及细胞中常规蛋白的检测，但需有暗室等相关配套条件。编号名称说明SW2010Westernblotting(小鼠IgG)ECL显色试剂盒可配制250ml二抗和50ml显色液，适合一抗为小鼠IgG。SW2020Westernblotting(兔IgG)ECL显色试剂盒可配制250ml二抗和50ml显色液，适合一抗为兔IgG。SW2030Westernblotting(山羊IgG)ECL显色试剂盒可配制250ml二抗和50ml显色液，适合一抗为山羊IgG。SW2040Westernblotting(小鼠/兔IgG)ECL显色试剂盒可配制250ml二抗和50ml显色液，适合一抗为小鼠和兔IgG。试剂盒内容：1.封闭试剂：30g(可配制400ml)脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。2.10倍浓缩抗体稀释液，50ml。3.HRP标记二抗，0.1ml，效价1：2000-5000。4.ECL显色液，25mlA+25mlB。操作步聚常规电泳转膜后，1.清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。2.按5g封闭试剂加100ml双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液，将漂洗过的转印膜，封闭液内，摇床震动，室温封闭30min。用TBS-T，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。3.将10抗体稀释液用双蒸水稀释成1（10ml10抗体稀释液加入90ml双蒸水，混匀，可4保存三个月）。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。4.用1的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4孵育过夜或37摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分别作好标记，分开孵育。5.用TBS-T，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。6.用稀释好的抗体稀释液稀释二抗。根据用量，DAB法按10ml抗体稀释液加入20ulHRP标记二抗（1：500）的比例；ECL法按10ml抗体稀释液加入5ulHRP标记二抗（1：2000）的比例，配制二抗工作液，混匀。将杂交膜放入杂交袋中，加入二抗工作液，封口，37摇动孵育1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。7.用TBS-T，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次10min。8.显色：a)DAB显色：配制DAB显色，根据用量，取TBS-T4ml，加入DAB显色液A、DAB显色液B各200ul，混匀，加在膜正面，室温下显色。在目标条带显出后，而且背景未出时，放入水中终止显色。b)ECL化学发光法检测：配制ECL