《微生物HX》PPT课件.ppt

大肠杆菌生长曲线的测定 大肠杆菌 介绍 为革兰氏阴性短杆菌 大小0 5 1 3微米 周身鞭毛 能运动 无芽孢 能发酵多种糖类产酸 产气 使人和动物倡导中的正常栖居菌 婴儿出生后即随哺乳进入肠道 与人终身相伴 其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长 减少蛋白质分解产物对人体的危害 还能合成维生素B和K 以及有杀菌作用的大肠杆菌素 大肠菌群数常作为饮用水和实物的卫生学标准 主要特点 1 细菌 原核生物 肽聚糖组成的细胞壁 只含有核糖体简单的细胞器 无细胞核有拟核 细胞质中的质粒作基因工程中的运载体 2 代谢类型 异养兼性厌氧型 3 与人体关系 正常状况下 可认为互利共生 高中 在致病的情况下 可认为寄生 4 培养基中加入伊红美蓝 菌落呈深紫色 并有金属光泽 鉴别杆菌是否存在 5 目前杆菌是应用最广泛 最成功的表达体系 常做高效表达的首选体系 6 在生态系统中的地位 假如它生活在大肠内 属于消费者 假如生活在体外则属于分解者 7 基因组DNA为拟核中的一个环状分子 同时可以有多个环状质粒DNA 生长周期 细菌接种到均匀的液体培养基 在生长过程中 有以下生长周期 1 迟缓期 数量维持恒定 或增加很少 2 对数生长期 最大速率生长和分裂 细菌数呈对数增加 3 稳定生长期 细菌数最高并维持稳定 4 衰亡期 细菌死亡速率增加 活细菌减少 细菌的生长一般指群体的生长 常常具有一定的规律性 大多数细菌的繁殖速率很快 在合适的条件下 一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次 将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中 以菌数的对数为纵坐标 生长时间为横坐标 作出的曲线称为生长曲线 在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期 对数期 稳定期和衰亡期四个阶段 生长曲线 实验目的 1 了解细菌生长曲线特点及测定原理 2 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律 绘制生长线 3 学习用光电比浊法测定细菌的生长曲线 目标与要求 1 会使用分光光度计测定光密度值2 会培养不同浓度的菌液3 会使用恒温摇床培养细菌4 能用已测定光密度值绘制大肠埃希氏菌生长曲线 实验原理 不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同 同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同 本实验用分光光度计 spectrophotometer 进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值 绘制生长曲线 工作过程 5 结果处理 3 接种 1 备料 灭菌 4 培养 接受指令 6 报告结果 查找依据制定计划 实施操作 7 评价质量 2 取样 项目八大肠杆菌生长曲线的测定 工作准备 1 菌种 大肠杆菌 大肠埃希菌 2 培养基 营养肉汤培养基 配法书上134页 3 仪器和器具 721光电比色计 恒温摇床 无菌吸管10mL 试管 无菌平皿 酒精灯 接种环 培养箱 三角瓶 操作步骤 接种培养分别用10ml无菌吸管吸取5ml大肠杆菌过夜培养液 培养10 12h 转入盛有100ml营养肉汤的三角瓶内 接种后 轻轻摇荡 使菌体混匀 将九组三角瓶置于摇床上 37 220r min 振荡培养 间隔一段时间后 即0 2 4 6 8 10 12 14 16 18h 从摇床上取下一瓶培养物 标记时间 置4 冰箱培养 分光光度计比浊测定每组取10支干净小试管 从不同时间培养菌液中摇匀各取3ml 将大肠埃希菌培养液进行适当稀释 使光密度在0 1 0 65之间 以没有接种的空白对照组培养基调零点 在550nm或600nm波长 1cm比色杯中依次进行测定OD值 测定从最稀浓度的菌悬液开始 依次测定 经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数 才是培养的实际OD值 注意事项 1 选择试管时应选取质地相同 内外直径一致 管壁厚薄均匀的试管 在比色管架上以分光光度计的计值法选取则更为精确 2 在生长曲线测定中 要用空白对照管的培养液校正光度计的零点 3 测OD值前 培养液振荡 细胞均匀分布 后将比色杯的菌液倾入容器中 用水冲洗 水集于容器灭菌 用75 酒精冲洗比色杯 4 测定OD值时 要求从低浓度到高浓度测定5 严格控制培养时间 实验报告 将测定的OD600值填入下表 绘制生长曲线以光密度 OD值 为纵坐标 生长时间为横坐标 作出大肠埃希菌生长曲线 并说明大肠杆菌生长特征 思考题 1 为什么比浊法测定细菌的生长只表示细菌的相对生长状况 它有何优点 2 用光电比浊计测定OD值应如何选择其波长 为什么要用未接种的牛肉膏蛋白胨液作空白对照 3 什么叫生长曲线 单细胞微生物的典型生长曲线可分几期 其划分的依据是什么 4 如果用活菌计数法制作生长曲线 你认为会有什么不同 两者各有什么缺点 细菌细胞密度 OD600 实验室确定细菌生长密度和生长期 多根据经验和目测推断细菌的生长密度 在遇到要求较高的实验 需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度 OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法 以未加菌液的培养液作为空白液 之后定量培养后的含菌培养液 为了保证正确操作 必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数 做出校正曲线 实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值 原因是采用了显色的培养基 即细菌培养一段时间后 与培养基反应 发生变色反应 另外 需要注意的是 测试的样品不能离心 保持细菌悬浮状态 使用方法 1 接通电源 打开仪器开关 掀开样品室暗箱盖 预热10分钟 2 将灵敏度开关调至 1 档 若零点调节器调不到 0 时 需选用较高档 3 根据所需波长转动波长选择钮 4 将空白液及测定液分别倒入比色杯3 4处 用擦镜纸擦清外壁 放入样品室内 使空白管对准光路 5 在暗箱盖开启状态下调节零点调节器 使读数盘指针指向t 0处 6 盖上暗箱盖 调节 100 调节器 使空白管的t 100 指针稳定后逐步拉出样品滑竿 分别读出测定管的光密度值 并记录 7 比色完毕 关上电源 取出比色皿洗净 样品室用软布或软纸擦净 注意事项 1 该仪器应放在干燥的房间内 使用时放置在坚固平稳的工作台上 室内照明不宜太强 热天时不能用电扇直接向仪器吹风 防止灯泡灯丝发亮不稳定 2 使用本仪器前 使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理 以及各个