壳聚糖微球的制备及研究-开题报告.doc

壳聚糖微球的制备及研究摘要：壳聚糖是性能优良的天然黏膜黏着剂，常用于多肽类药物的黏膜给药。壳聚糖微球除具有壳聚糖本身特点外，在性能上又有新的改善，利用壳聚糖制成的微球可以延长药物在吸收位置的保留时间，达到控释目的。实验以戊二醛，多聚磷酸钠为交联剂制备微球，通过单因素法考察微球制备工艺。关键词：微球，壳聚糖，戊二醛，多聚磷酸钠 1 研究背景1.1 微球微球是近年来发展的新剂型，它是以清蛋白、明胶、聚乳酸等材料制成的球状载体给药系统，微球中的药物分散或包埋在材料中而形成球状实体，微球直径大小一般为0.3100m。不同粒径范围的微球针对性地作用于不同的靶组织。这类剂型的开发，对于发展缓控释和靶向给药系统具有重要的意义。1.1.1 微球的特点药物制备成微球后可达到下述目的：掩盖药物不良气味及口味，如鱼肝油、生物碱类等；提高药物的稳定性，如易氧化的-胡萝卜素、对水气敏感的阿司匹林等；使液态药物固体化便于应用与储存，如油类、香料、脂溶性维生素等；对缓释或控释药物，可采用惰性基质、薄膜、可生物降解材料、亲水性凝胶等制成微球或微囊，可使药物控释或缓释；使药物浓集于靶区，如治疗指数低的药物或细胞毒素药物（抗癌药）制成微球或微囊的靶向制剂，可将药物浓集于肝或肺等靶区，提高疗效，降低毒副作用；除药物外，可将活细胞或生物活性物质包囊，如胰岛、血红蛋白等包囊，在体内生物活性高，而具有很好的生物相容性和稳定性1。1.1.2 各种微球的制备研究1.1.2.1 清蛋白微球 清蛋白微球制剂是人或动物血清清蛋白与药物一起制成的一种球状制剂。清蛋白是体内的生物降解物质，注入肌体后，在肌体的作用下逐渐降解后清除，性能稳定、无毒、无抗原性，因此清蛋白微球制剂是理想的控缓释靶向制剂之一。其制备方法有：热变性法；化学交联法（即用化学交联剂同清蛋白发生交联反应使之变性）；聚合物分散法和界面缩聚法等。 1.1.2.2 聚乳酸、聚乳酸乙醇酸微球聚乳酸(PLA)是一种无毒可生物降解的聚合物，具有很好的生物相容性。目前，大部分PLA和PLGA微球均采用乳化分散法和相分离凝聚法制备。其中相分离法适合于水溶性药物微球的制备，乳化分散法对水溶性、脂溶性药物均适宜。1.1.2.3 明胶微球以明胶作载体材料，无不良反应，无免疫原性，具有生物可降解性，是目前动脉栓塞的主要材料，应用广泛。丁红等2用乳化化学交联法制备阿霉素明胶微球，对其粒径及分布、体外释放药物进行了研究，并在此基础上进行了动物栓塞效果的初步实验。1.1.2.4 壳聚糖微球壳聚糖无毒，具有很好的生物相容性和生物可降解性。壳聚糖曾被提出制成微球，包封小分子抗炎药物。壳聚糖微球的制备有乳化交联、蒸发溶剂、喷雾干燥等方法。Nishioka Y3等考察了抗癌药顺氯氨铂-壳聚糖微球的释放特性，结果表明药物包藏量随壳聚糖含量增大而显著增加，壳聚糖的掺入对微球初始破裂有抑制作用，药物释放速度明显减少。1.1.2.5 聚羟基丁酸酯微球聚羟基丁酸酯(PHB)为微生物合成的新型可降解材料，生物相容性好，具有中长期降解周期。其化学结构式为：-CH(CH)3-CH2-CO-O- ，它比PLA、PLGA降解周期长，生物相容性更好，较适合作为中长期控释药物的载体。与目前已有的其他可生物降解材料相比，有易纯化、无残留催化剂等优点。实验研究结果与同剂量的原药组相比，延长抗生育效果更显著，不良反应小，安全性高。1.1.2.6 磁性微球目前，磁性微球作为一种新型的生物分离技术和靶向药物的载体，受到人们的广泛关注和研究。磁性微球根据其组成材料的不同可分为磁性高分子微球、磁性生物大分子微球和磁性无机物微球。磁性微球给药载体的特点是减少用药剂量，增强药物对靶组织的特异性，提高疗效，减少不良反应。1.1.2.7 生物黏附微球生物黏附微球是指药物与黏附材料分散在载体中。这类微球在到达黏膜表面时，其中的黏附材料可与生物黏膜产生黏附作用，从而在黏膜表面滞留较长时间，并持续释放药物。其制备方法有喷雾干燥法、溶媒干燥法4等。1.1.3 壳聚糖微球的应用1.1.3.1 缓控释给药壳聚糖是一种弱碱，在中性和碱性条件下不溶。在酸性介质中，其氨基在溶液中被质子化，成为带正电的多聚糖，故通常使用pH值13的醋酸缓冲液作为壳聚糖溶液的溶剂。壳聚糖分子内具有活性基团氨基，可与含双官能团的醛类或酸酐类药物发生化学交联，使药物大量分布于交联结构内，缓慢释放，包封在壳聚糖微球内的药物具有明显的缓释、控释或延时释药5的特征。1.1.3.2 靶向给药壳聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通过控制壳聚糖微球的大小、形状，选择适当的给药方法，能够提高壳聚糖微球的靶向效果。1.1.3.3 生物大分子给药随着生物技术的发展，疫苗、蛋白质这类药物具有活性高、疗效稳定、毒副作用小、用量少等突出优点，但是疫苗、蛋白质类药物还具有分子质量大，在体内外的稳定性差，容易受体内酶、微生物、体液所降解，生物膜通透性差，半衰期短等缺点，使得疫苗、蛋白质类药物的临床应用大受限制。而将疫苗、蛋白质类药物制成微球系统给药，不仅能够有效防止药物在体内的很快降解，还能将药物缓慢释放并靶向送达体内的作用部位，从而达到长效缓释靶向目的。1.1.3.4 黏膜黏附给药壳聚糖具有较好的黏膜黏附性，在酸性环境下黏附力最强，且具有一定的促渗作用。壳聚糖的黏附机制主要是与黏液中的糖蛋白产生非共价键，如氢键、范德华力、离子间的相互作用等。1.1.3.5 降低药物的毒副作用，提高疗效载有药物的壳聚糖微球随血液循环到达靶区周围释放药物，使靶区周围很快达到有效的治疗药物浓度，而在机体其他部位药物的分布量较小，从而减少了对机体正常组织的毒副作用。同时由于载体壳聚糖自身具有一定的生理活性，与药物可产生协同作用增强疗效。 1.1.3.6 提高疏水性药物对细胞膜的通透性壳聚糖微球溶胀引起的扩散释药过程可以增加药物在吸收部位的浓度梯度，对药物的吸收具有协同促进作用。同时壳聚糖分子可以改变膜转运机制，打开细胞通道，有利于提高药物在细胞间瞬间渗透的能力，促进药物在细胞内发挥药效。壳聚糖微球可以改变膜转运机制，增加药物对生物膜的通透性，有利于药物在细胞内发挥药效。1.1.3.7 提高药物的稳定性抗生素口服给药时存在作用部位浓度低、滞留时间短，在酸性胃液中不稳定等问题。壳聚糖微球作为抗生素药物的载体，能提高药物稳定性，保持药物活性。另外，随着生物技术的发展、基因重组肽和蛋白质药物不断涌现，且越来越多地应用于临床。与化学合成药物相比，肽类药物6具有毒副作用轻，吸收快的特点，但由于此类药物在胃肠道内极易被酶降解，因而临床上一般采用注射方式给药；因其普通注射剂半减期较短，为维持体内有效治疗浓度，需要长期频繁注射给药，如采用皮下或肌肉注射，生物利用度也不高；此外，多数肽类药物不易透过生物膜屏障，从而使疗效受到影响。若考虑将这类药物用壳聚糖包覆后可明显提高药物的稳定性。1.1.3.8 基因治疗壳聚糖是一种并不多见的无生物毒性的碱性多糖，具有良好的组织相溶性，易于生产和储存，成为一种高效载体应用于基因治疗7领域。1995年，Mumper等人首次进行了壳聚糖-DNA复合物的制备。这种复合物是壳聚糖以溶液的形式与DNA自聚集形成沉淀，从而制备得到大小为150-500nm的微球，使它在基因治疗领域作为载体成为可能。壳聚糖作为一种具有广泛应用的基因治疗载体，对其应用目前仅限于实验室研究，有待进一步系统深化。2 文献综述2.1 壳聚糖甲壳素(chitin)是广泛存在虾、蟹和昆虫甲壳中的物质，也存在于低等植物中，如：菌、藻类的细胞壁中，自然界每年生物合成的甲壳素有数十亿吨之多，在自然界的含量仅次于纤维素，壳聚糖(CS)是甲壳素的脱乙酰产物。由于壳聚糖分子内存在大量的游离胺基，使其溶解性能提高，反应活性增强，从而应用范围也大大拓宽，所以壳聚糖在化工、轻工、医药、食品及环境保护等领域中的开发应用研究十分活跃8。2.1.1 壳聚糖的性质壳聚糖，学名为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是自然界存在的唯一碱性多糖，通常甲壳素的脱乙酰度超过55时就叫壳聚糖，而作为工业品的壳聚糖，N-脱乙酰度在70以上，不溶于水和有机溶剂，可溶于pH6.5的稀酸。在稀酸中，其葡萄糖氨基转化为R-NH3+ ，形成聚阳离子凝胶溶液9。具有良好的生物相容性和生物可降解性，不仅无毒无味，而且有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸、抗溃疡、降脂、降低胆固醇及直接抑制肿瘤细胞的作用。2.1.2 壳聚糖在化工、生物领域的应用研究甲壳素及其衍生物的应用很广泛，可以用作纺织品的防缩、防皱整理剂，涂料印花固着剂以及防雨布上浆剂。利用壳聚糖制成的高效絮凝剂能够有效地改善水质，对工业废水的金属离子有着良好的吸附性能，并可以从海水中吸附铀，在造纸工业上可以制成纸张整理剂，提高纸张的抗拉、抗撕强度以及电绝缘性能等。在医疗方面也有着广泛的应用，利用壳聚糖制成具有良好的生物相容性的吸水薄膜，制成合成皮肤10可用于医治烧伤，利用壳聚糖制成的隐形眼镜片无须用机器打磨，大大降低隐形眼镜的成本。在农业中充分利用甲壳质，则可增加产量。在种籽表面涂上一层壳聚糖，就能减少真菌的侵袭，加强植物的抗病能力，也可防虫害。试验证明，在小麦和豌豆的种籽上涂一层甲壳质，就能使产量增加一成或三成。同时也可以用作食品及饲料添加剂及高级食品的软包装材料，例如，将壳聚糖用超声波降解为低壳聚糖，此糖具有抗肿瘤的生理功能，是双歧乳杆菌的生长因子，而且它还具有促进四环素、镭素等抗菌素吸收进入血液中的效用，对人体有益无害。因而可代替常用的防腐剂苯甲酸钠和苯甲酸（这两种物质对肝功能衰弱的人是有害的）。又因为壳聚糖来源丰富，具有机械性能良好，化学性质较稳定、无毒、无抗原性等特点，一般可用作固定化酶载体11。在化妆品工业上也有着广泛的应用，将壳聚糖经羧甲基化得到的羧甲壳聚糖，它与透明质酸（在医学、化妆品工业中得到广泛应用）具有十分相似的分子结构，日后有望替代透明质酸。2.1.3 壳聚糖在医药方面的研究壳聚糖有杀菌、抑菌、消炎和促进伤口愈合的功能，还可降低胆固醇，增强免疫力，排除体内毒素，且有亲和性，不与体液起反应，也无抗原反应。早在1979年，学术界就将其抗菌机理推测分为两类，一类是以细菌带负电荷的细胞膜为作用靶的机理；另一类是以细菌分子中DNA为作用靶的抗菌机理。由于壳聚糖本身特有的性质，能与许多物质化合，制成特殊的药物，以壳聚糖为包裹材料包埋自制的磁流体，并偶联色素配基得到一种新型亲和磁性毫微粒，这种微粒在细胞分离、固定化酶、免疫诊断及肿瘤靶向治疗等许多方面均有应用。将壳聚糖和丝心蛋白共混可交联成半互穿聚合物网络结构，具有智能水凝胶的性能，用此聚合物制成包药微球，形成缓释剂，减少服药次数和药物的不良反应。2.2多聚磷酸钠多聚磷酸钠(TPP)，分子式为Na5P3O10，是一种白色结晶或结晶性粉末，有吸湿性，溶于水。在酸性溶液中煮沸，水解成正磷酸盐。有刺激性，对碱金属与重金属盐有络合能力，能软化硬水，可调节缓冲皂化值的pH值。具有离子交换性能，使悬浮液变成溶液，一般作为分离分散和抗絮凝剂，分离碱土和重金属离子。主要用作合成洗涤剂的助剂、钻井泥浆分散剂、造纸用油点防止剂和陶土分散剂。2.3 戊二醛戊二醛(GTA)由于分子式两端各有一个醛基，是一种优良的双官能团交联剂。它与蛋白质交联的特点是交联性能好，结合量多，结合牢固性较大，且能够保持蛋白质的原有构型。戊二醛主要应用于生物医学工程、免疫化学、皮革化学、食品微生物工业、石油开采、环境保护等诸多工业。2.4 两步固化法离子交联法是目前在载药壳聚糖微粒的研究中使用最多的制备方法。它是利用无不良反应的三聚磷酸钠(TPP)对壳聚糖进行离子诱导凝胶化形成微球。在室温搅拌下，将pH值79的TPP溶液滴加到pH值46壳聚糖乙酸溶液中，通过带负电的磷酸根离子与壳聚糖分子链上带正电的质子化氨基发生分子内和分子间交联凝胶化，便可迅速生成微球。Xu等将不同相对分子质量和脱乙酰度的壳聚糖制成不同浓度的乙酸溶液，再与不同浓度TPP反应。在包裹牛血清白蛋白(BSA)的实验中发现，当TPP质量浓度为1 gL-1 时，降低壳聚糖溶液质量浓度至0.5gL-1，会出现大粒径的聚集体；增大壳聚糖质量浓度至4 gL-1，BSA包封率降低。另外，壳聚糖相对分子质量和脱乙酰度的增加都能提高BSA的包封率，同时也都会降低BSA的体外释放速率。化学交联法利用壳聚糖分子链上的氨基或羟基与一些化学交联剂反应的特性，可在一定条件下制备出药物微球。有实验表明，微球粒径随交联度增加而数倍地增长，另外透射电镜显示高交联度粒子容易发生聚集现象。需要指出的是，化学交联往往会对细胞的存活率和大分子药物的完整性产生不利影响，且交联剂毒性较大，因而用该法制得的壳聚糖药物载体在应用上有一定局限性。3 技术路线3.1 TPP-GTA为交联剂制备CS微球取一定量的CS溶于2ml HAc溶液中，作为水相。将液体石蜡20ml和1.0%的吐温-80加至水相中，室温2000rmp搅拌乳化30 min制成W/O型乳剂，在磁力搅拌的作用下加入0.3ml一定浓度的GTA固化，固化一定时间后，加入定量的石油醚离心10min，倾去油相，用去离子水洗涤数次，冷冻干燥，制得载药微球。3.2 CS微球表面形貌观察采用透射电镜观察形态下观察微球形态。 3.3 CS微球体外释放性能的研究精密称取CS微球约10mg置透析袋中，加磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4) 2ml，然后用透析夹夹紧，静置于100ml PBS中。分别于10min，20min，30min，1h，2h，3h，5h，8h，16h，24h，48h从外部溶液中取样3ml，同时补充磷酸盐缓冲液3ml。所取样液测定其266 nm处紫外光密度值，由标准曲线方程计算药物累计释放率。4 进度安排9月22日9月28日 在导师指导下，准备资料、仪器设备，并确定课题。9月28日10月22日 撰写开题报告、翻译文献。制备微球颗粒；考察体外释放性能；观察微球成球性。10月22日10月30日 撰写论文。5 参考文献1陈智,田景振.药用微球应用概况J.齐鲁药事,2009,28(3):164-167.2丁红,刑桂琴,谢茵.阿霉素明胶微球的制备与特性研究J.中国医院药学杂志,2000，20(7):387-389.3Nishioka Y,Kyotani S,Okamura M,et al.Release characterist ics of c