BDELISPOT技术2

BD ELISPOT 单细胞分析技术,中山大学基础医学院免疫教研室吴长有,BD ELISPOT简介,BD ELISPOT是在ELISA 技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术 。由于其可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。,ELISPOT技术的过去,ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。直到1996年PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。,ELISPOT 技术的现在,1996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。,ELISPOT 未来展望,ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应形式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的指标之一。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。,ELISPOT与ELISA的比较,ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的 细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：1. ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。 2. ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过北京赛智创业生产的ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）3. 由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。 4. 捕获抗体为BD生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。,BD ELISPOT技术优势,单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子观察活细胞应答（动态）而非检测培养上清、血清、血浆、裂解液（静态）结果以斑点显示, 能计数效应细胞，分析效应分子产生频率of Spots: cell numbers/ frequencysize of Spots: relative amount produced高灵敏度最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和 ELISA 法测量的精度。因为抗原特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。 高产量 ,大容量T 细胞分析成为可行。只需要少量样本即可进行检测分析。淋巴细胞在 ELISPOT 分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。 低温储藏后的淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。,BD ELISPOT应用,移植研究疫苗开发 -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2细胞转换分析 自体免疫研究 免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究 -肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨 IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子研究 传染疾病研究体液免疫研究 B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究,BD ELISPOT原理,ELISPOT实验设计是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔板中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素（Biotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。,BD ELISPOT 流程,1针对被分析物的 捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上,2用完全培养基将板底封闭,BD ELISPOT 流程,3加入抗原、肽段或有丝分裂素等刺激剂，加入细胞悬液孵育一定时间以激活细胞细胞受刺激后分泌的蛋白紧靠在细胞周围，与已固定的捕获抗体结合,4孵育一定时间后洗去细胞分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获,BD ELISPOT 流程,5加入生物素标记的针对被分析物的检测抗体检测抗体与被分析物结合，形成 夹心三明治复合物,6加入与辣根过氧化物酶(HRP)连接的亲和素亲和素与检测抗体上的生物素结合,7.加入底物溶液（AEC Chromogen）与酶发生显色反应，监测颜色斑点的形成，终止底物反应，室温风干，避光保存于封口塑料袋中直至分析颜色斑点,BD ELISPOT 产品特色,BD ELISPOT Kit：2 coated plates和所需全部试剂BD ELISPOT Set: Detection Ab , Capture Ab， Streptavidin-HRP和 10 uncoated platesBD ELISPOT Pair：Detection Ab和Capture Ab for 5 plates（捕获抗体和检测抗体为高特异性单抗）,BD ELISPOT具体操作（一）,人外周血淋巴细胞按如下方法分离获取：15ml外周血+250U肝素（1520U/ml），用Hanks液1：1稀释。30ml稀释的血样叠加于20ml淋巴细胞分离液表面，800g，室温，离心25分钟。去上清，收集PBMC（约15ml），加15mlHanks液，混匀，800g，室温，离心10分钟, 洗涤两次。去上清，加2ml 1640完全培养基，取部分悬液计数细胞.根据计数细胞调整细胞浓度到2X106/ml。,BD ELISPOT具体操作（二）,无菌操作：1 抗IFN-抗体用无菌PBS（PH7.2）1:200稀释, 100ul/孔, 4包被过夜（如为BD ELISPOT Kit，则从步骤3开始） 。2 轻轻甩去液体，在灭菌吸水纸上拍板，直至拍干。用1640完全培养基200ul/孔洗涤2次，200ul/孔完全培养基室温下封闭2小时。3 去培养基。在每孔中加入100 ul含2X刺激物的完全培养基，再加入100 ul 2X106/ml淋巴细胞，37 5%CO2培养箱孵育20小时。,BD ELISPOT具体操作（三）,4 20hr后，甩去细胞悬液，去离子水200ul/孔洗涤2次，PBST溶液（PBS中加入0.05%tween20, PH7.2）洗涤3次，200ul/孔，600rpm震荡35分钟。5 轻轻甩去洗液，拍干，用滤纸吸去残液。6 用含10%FCS的PBS按1：250稀释检测抗体，过滤，100ul/孔，室温下孵育2小时。7 用PBST洗涤3次，3分钟，200ul/次。8 准备HRP溶液：用含10%FCS的PBS按1:100稀释HRP, 100ul/孔溶液加入ELISPOT板中, 室温下孵育1小时.9 弃掉液体，拍干。200ul/孔PBST洗涤4次后用PBS洗涤2次.10 配制底物: 20ulAECchromogen+1mlAEC溶液，.混匀后100ul/孔. 室温下避光放置560分钟，100ul/孔去离子水终止显色, 用去离子水200ul/孔洗涤后晾干，读板.,BD ELISPOT 结果显示,Blank controls:G1-9: 无刺激剂的细胞H1-9: 无细胞的刺激剂,样本孔出现颜色斑点Usu. 1020 mm,BD ELISPOT 结果分析,在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞用Elispot Reader 进行分析对斑点自动计数，并做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能平衡背景信号。软件自动计算出细胞的分泌频率,BD ELISPOT 应用示例,在预包被了抗人IFN-g 的NA/LE抗体的BD ELISPOT微孔板中，加入人PBMCs，经PMA和ionomycin 刺激过夜，用生物素标记的抗人IFN-g检测抗体。加入亲和素-HRP和底物显色后，Immunospot Series Analyzer自动、快速、精确地进行图象分析和斑点计数（如左图），图象分析系统进一步对斑点大小做分析统计，给出斑点大小分布图（如右图）。,Superior human IL-2 ELISPOTs are obtained using BD ELISPOT Set with a cocktail of capture antibodies. Human PBMCs were stimulated (overnight) with PMA (5 ng/ml; Sigma, Cat. No. P-8139) and ionomycin (500 ng/ml; Sigma, Cat. No. I-0634) in the microwell of a BD ELISPOT plate pre-coated with a cocktail of NA/LE anti-human IL-2 antibodies. Biotinylated anti-human IL-2 antibody was used to detect the captured IL-2 produced and secreted by individual cells within the activated cell population. Spots were visualized using avidin-HRP enzyme and AEC substrate. Panels A and B were derived from experiments conducted using the same activated cells in the same ELISPOT plate. Panel A: BD ELISPOT Human IL-2 Set (BD Biosciences Pharmingen, Cat. No. 551282). Panel B: Suboptimal human IL-2 ELISPOT using other antibodies .,ELISPOT analysis of co-stimulated mouse IL-2 secreting cells. BALB/c mouse spleen cells were incubated in an ELISPOT plate that was hand coated with 5 g/ml of anti-mouse IL-2 capture antibody (BD Biosciences Pharmingen, Component No. 51-1816KC in the BD ELISPOT Mouse IL-2 Set, Cat. No. 551076) and 1 g/ml anti-mouse CD3 (BD Biosciences Pharmingen, Cat. No. 553057 ), with or without 2 g/ml soluble anti-mouse CD28 (BD Biosciences Pharmingen, Cat. No. 553294) overnight. Biotinylated anti-mouse IL-2 detection antibody was added at 2 g/ml (BD Biosciences Pharmingen, Component No. 51-1817KC in the BD ELISPOT Mouse IL-2 Set, Cat. No. 551076). Thereafter, the plates were developed according to the BD ELISPOT assay protocol. Panel A shows the image of spots and panel B shows the spot size distribution from the plate well wherein cells were stimulated with plate-bound anti-mouse CD3 and soluble anti-mouse CD28. Panel C and panel D show the spots image and size distribution in a plate microwell wherein cells were stimulated with plate-bound anti-mouse CD3 only.,BD ELISPOT 操作注意事项,1.操作时注意不要触及PVDF膜的底部。2.为获得优化的实验结果，在第一次实验时可使用不同的细胞浓度（103106cells/microwell)。3.在细胞培养过程中不要摇动ELISPOT板，防止斑点模糊。4.在培养箱孵育过程中，不要将ELISPOT板重叠，防止边缘效应。5.背景过高的克服方法：增加洗涤的次数。在显色之前用PBS洗涤以去除Tween-20，防止对显色的干扰。如果需要,增加干燥ELISPOT板的时间。彻底洗去细胞减少非特异性斑点。掌握好显色时间，防止过度显色。6.实验结束后将ELISPOT板室温晾干，不能高于37防止损坏PVDF膜。7.待ELISPOT板干燥后，将其保存在密封的塑料袋中防止褪色。,BD ELISPOT产品信息,HumanGM-CSF ，Granzyme B ，IFN-g ，IL-2 ，IL-4 ，IL-5IL-10 ，IL-12p70 ，LIF ，TNF MouseIFN-g ，IL-2 ，IL-4，IL-5 ，IL-6 ，IL-10 IL-12p70 ，TNF RatIFN-g ，IL-4,ChampSpot酶联斑点分析系统简介,ELISPOT Reader 的应用,ChampSpot酶联斑点分析系统简介技术指标:1、 全封闭机箱：保证不受外部光源干扰。2、 自动化96孔板样品载物台（标配）：支持6、12、24、48、96孔透明或不透明板，以及PVDF膜、尼龙膜、硝化纤维膜等其它孔底膜。3、 精确定位系统的全自动X、Y轴运动平台,自动控制元件。4、 专业级体视显微镜头：可缩放0.5-6.5倍。5、 优化设计环形光源：可去除由板孔壁造成的幻影。6、 均匀的底部透射光源：使每个板孔的背景更加均匀，能更好的帮助软件区分板孔里的边沿点、粘连在一起的点、杂质点、融合点、真正的斑点。7、 高分辨率彩色CCD：752*582像素8、 M2/4B专业级图像采集卡（标配）9、 ELISPOT酶联斑点图像分析软件：每块板的采集、自动分析、数据保存、输出，在15分钟内完成。10、FastShot自动拍摄软件：2分钟内扫描整块96孔板。,ELISPOT酶联斑点分析软件和ELISPOT计数分析软件,1、 完成整块板的计数只需5个步骤。2、 整块板的采集、分析、数据保存、输出，在15分钟内完成3、 强大的斑点处理功能4、 图象自动修复：可自动减切修复每个孔的内圈图象，有效的区分了孔壁与孔底的连接处。5、 具有单、双、多色斑点分析功能。6、 分析模式：给用户提供全自动、半自动、手动三种分析模式，同时可任意指定对整块ELISPOT板、列、行或单个微孔进行分析。7、 单个孔的图片或整块板的图片都可直接，复制或导入到Photoshop、PowerPoint、Word、等软件中进行编辑，同时可将图片转换成TIFF或者JPEG格式保存。8、 整块板或单个孔的数据表格都能保存、打印，并