贝类毒素的测定

贝类毒素的测定 生物法,一、麻痹性贝类毒素（PSP） Para1ytical shellfish poisoning,PSP中毒是最常见的食用贝类中毒PSP由一组石房蛤毒及其衍生物组成，PSP与涡鞭毛藻的水华有关（106个细胞升）PSP在世界范围内分布 PSP中毒引起神经系统紊乱，呼吸困难，感觉窒息，心肺衰竭而在224小时内死亡一般PSP中毒在0.5-2h的时间内，症状逐渐发展，能承受12h以上的中毒者一般能康复,麻痹性贝类毒素的测定方法,国际上麻痹性贝类毒素的检测方法较多，主要有小白鼠法、高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等。生物法(即小白鼠法)是国际惯用的麻痹性贝类毒素的测定方法，已被美国公职分析化学家协会公定分析方法（AOAO）收入，而成为最普遍应用的检验方法。生物法(即小白鼠法)，系采用ICR系列的小白鼠作为检验动物，进行贝类毒素分析生物法(即小白鼠法)优势：当使用生物法检测法时，一旦发现超标样品，则本批样品不得食用，这说明所检测贝类中相关的毒素含量已经影响到人们的食用安全，不适合食用。,麻痹性贝类毒素的测定生物法 (SC/T 3023-2003),原理根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，计算确定每100g贝肉中PSP的含量特点：测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的麻痹性贝类毒素的总量鼠单位 mouse unit，MU：对体重为20g的小白鼠腹腔注射1mL麻痹性贝类毒素后，小鼠在15min时死亡所需的最低毒素量,试剂盐酸溶液：0.1 mol/L盐酸溶液：5 mol/L氢氧化钠溶液：0.1 mol/L,仪器和设备均质器天平（感量0.1g）离心机pH计秒表玻璃皿；烧杯、量筒、容量瓶、搅拌棒等注射器：1mL注射器针头：8#,小白鼠： 体重为19-21g的健康ICR系雄性小白鼠 若体重19g或21g，查表中的校正系数便可得到校正的死亡时间 体重23g、或已用过的小白鼠则不能使用,样品的测定,检样的制备贝类 洗净外壳，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取贝肉，收集沥水5min（避免贝肉堆积），捡出碎壳等杂物，将贝肉均质,注意：取肉时切勿割破肉体，开壳前不能加热或用麻醉剂,样品的测定,检样的制备贝类罐头1.将罐内所有内容物（包括贝肉组织及汁液），于均质器中均质2.大容量的罐头，则过滤分离贝肉及汁液，分别称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质冷冻贝类 在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）呈半冷冻状态，按上述规定的方法清洗、开壳、淋洗、取肉、均质,样品的测定,提取取100g样品于800mL烧杯中，加0.1mol/L HCl溶液100mL充分搅拌，检查pH（pH应为2.0-4.0）。需要时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0.1mol/L NaOH溶液调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素,将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节pH至2.0-4.0（切勿4.5）。将混合物移至量筒中并稀释至200mL,样品的测定,提取将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min，或用滤纸过滤保留进行小鼠注射用的足量液体（约10mL）,样品的测定,小鼠试验选择ICR系小鼠称重：以感量为0.1g的天平将小鼠称重并记录重量,样品的测定,小鼠试验每个样品注射3只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL提取液。注射时若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠记录注射完毕时间，仔细观察 并用秒表记录小鼠停止呼吸时 的死亡时间（到小鼠呼出最 后一口气止）,样品的测定,小鼠试验若注射样品原液后，1只或2只小鼠的死亡时间大于7min，则需再注射至少3只小鼠以确定样品的毒力若小鼠的死亡时间小于5min，则要稀释样品提取液后，再注射另一组小鼠（3只），得到5min-7min的死亡时间稀释提取液时，要调节pH至2.0-4.0,逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl溶液,结果的计算与判断,毒力的计算根据小鼠的死亡时间，在附录B 中查出相应的每毫升注射液的鼠单位数M 将存活鼠的死亡时间视为大于60min即相当于0.875MU若试验动物重量19g或21g。则根据附录C查出重量校正系数k样品中PSP的含量按公式（1）计算。（1） 式中： X样品中PSP含量，每百克样品中鼠单位（MU / 100g） Ki每只小鼠的重量校正系数 Mi每只小鼠的鼠单位数，鼠单位（MU） D样品提取液的稀释倍数 200样品量，克（g）,结果的计算与判断,毒力单位转换样品中的毒力单位的按公式（4）计算。F80g /100g400MU/100g （3） F=5式中： F毒素转换系数； 80g /100g样品中PSP限量，g /100g 400MU/100g样品中PSP限量，MU/100g,二、腹泻性贝类毒素（DSP）Diarrhetic shellfish poisoning,DSP是由于双壳贝类滤食含毒的涡鞭毛藻而引起影响较严重的地区主要是日本和欧洲沿海国家，发病率高，引起许多国家地区的关注受DSP中毒的症状表现为消化功能紊乱（腹泻、呕吐、腹痛），食用含毒贝类后30分钟至几小时出现症状，中毒者一般在3-4天康复，尚无死亡病例,腹泻性贝类毒素的测定方法,在国际上对腹泻性贝类毒素的检测方法较多，主要有生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等生物法（小白鼠法，Mouse bioassay）是最常用的一种方法,腹泻性贝类毒素的测定 生物法(SC/T 3024-2004),原理用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩蒸干后，再以1%吐温60生理盐水溶解残留物，注射小白鼠观察存活情况，计算其毒力试剂和材料丙酮（分析纯）乙醚（分析纯）1%吐温-60生理盐水：称取1.0g吐温-60，溶于生理盐水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL,仪器和设备旋转蒸发器均质器磨口烧瓶：圆底，500 mL，250 mL，100 mL布氏漏斗：100mm分液漏斗：具塞，500 mL天平：感量0.1g刻度试管：10mL，具塞冰箱：0-5和-15- -20注射器：1mL注射器针头：8#小白鼠：体重为16-20g的健康ICR系雄性小白鼠,检样的制备,生鲜带壳的贝类用清水彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉体收集贝肉，沥水5min，捡出碎壳等杂物，迅速冷冻，贮藏备用注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色）。开壳前不能加热或用麻醉剂冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品（带壳或去壳的）呈半冷冻状态，按上述方法清洗、开壳、淋洗、取肉,检样的制备,取 样可以切取中肠腺的贝类（扇贝、贻贝、牡蛎等），称取200g贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细切混合做为检样，注意不要使中肠内容物污染案板 对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，做为检样为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等用过的器材应在5%的次氯酸钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；废弃的提取液等也应用5%的次氯酸钠溶液处理,提取,取处理好的中肠腺，或200g贝肉置于均质杯内，均质2min加3倍量丙酮，与样品充分搅拌均匀后，用布氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液,提取,将抽提液移入500mL的磨口烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，56）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物将浓缩液移入分液漏斗内，以100mL200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡(不能生成乳浊液)，静置分层后，去除水层(下层)用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移入250mL的磨口烧瓶中，减压浓缩(旋转蒸发器，35)去除乙醚,提取,以少量乙醚将浓缩物移入100mL磨口烧瓶中，再次减压浓缩去除乙醚以1%吐温60生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10mL。此时1mL试液相当于20g去壳贝肉的重量，以此悬浮液做为试验原液,小白鼠试验,振荡使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液将每只小白鼠称重，每三只小白鼠为一组，分别将1mL试液注射到小白鼠腹腔中同时，另取三只小白鼠作为对照组，注射1mL 1%吐温-60生理盐水于腹腔中观察自注射开始到24h