禽传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgGFc基因的克隆及在Hela细胞中的融合表达

禽传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgGFc 基因的克隆及在Hela 细胞中的融合表达,背景综述目的及意义技术路线研究内容结果与分析致谢,报告提纲,背景综述,病 原 体：IBV（单股正链RNA病毒，有囊膜）流行病学：呼吸道排毒;飞沫传播；潜伏期短；急性， 高度 接触性；自然感染仅发生 于鸡,雏鸡发 病最为严重；低温是发病的关键。临床症状：损害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等； 呼吸型、肾型、腺胃型等；检测诊断：病毒分离、病毒中和、血凝抑制试验、RT PCR；ELISA、AGP防 治： 预防为主（环境疫苗），治疗为辅,禽传染性支气管炎(IB),结合受体，诱导中和抗体、血抑抗体、CTL反应,S蛋白,E蛋白,M蛋白,N蛋白,infectious bronchitis virus IBV,参与病毒装配（与核衣壳相互作用，将其结合到囊膜 ）,具有大量抗原决定簇，能诱导产生中和抗体,参与病毒粒子的释放,IBV病毒粒子结构,背景综述,背景综述,S 蛋白：裂解为S1(90kD)和S2(84kD)的两个亚单位， 均为糖蛋白。S1蛋白：由520538个氨基 酸组成。S1功能：别并结合宿主细胞膜上特异性糖蛋白受体 参与膜融合 氨基端参与决定毒株的组织亲和性及毒力 抑制多数中和抗体,IBV S1蛋白,背景综述,IgG 水解: 2 Fab +Fc 大小相近,活性不同Fab：结合抗原Fc：结合活化补体 哺乳动物IgGFc 段能与SPA、SPG非特异性结合;将目的基因与IgGFc 基因融合表达，利于鉴定和纯化！,免疫球蛋白IgGFc段,IgGFc,目的及意义,克隆猪IgGFc 和IBV S1基因，为进一步开发以这两个基因为基础的疫苗和诊断方法做基础。 表达S1-IgGFc，以IgGFc为蛋白标签，以期进一步利用亲合层析或免疫沉淀法，进行IBV细胞受体的分离与鉴定 。,技术路线,研究内容,一. 猪IgGFc 基因的克隆和序列分析二. IBV S1基因的克隆和序列分析三. 表达载体的构建四. 重组表达载体在 Hela 细胞上的表达,结果与分析,猪IgGFc 基因扩增,一. 猪IgGFc 基因的克隆和序列分析,扩增区域：铰链区C末端 不包括信号肽目的片段：1002 bp 上 游：EcoRI 位点下 游：XhoI 位点,猪IgGFc 基因的RT-PCR扩增,pMD18TIgGFc 构建,图 pMD18T-IgGFc/EcoRI+XhoI酶切,鉴定:EcoRI+ XhoI阳性：2680bp+1002bp,猪IgGFc 基因的克隆和序列分析,IgGFc 序列分析,测序结果：所获序列(略)1002 bp，与预期一致，无终止子，334个氨基酸Blast比对：100 gi5052049, gi47523191, gi43312794% gi33125蛋白预测：分子量大小约37 kD等电点为6.58在体内半衰期约100h，不含跨膜区不含信号肽，与预期相符,猪IgGFc 基因的克隆和序列分析,二. IBV S1基因的克隆和序列分析,IBV S1基因的克隆,S1基因PCR产物的电泳分析,模板：含M41株S全长的质粒目的：19536氨基酸上游 BamHI，下游EcoRI去掉了信号肽保留裂解识别位点部分碱基，以增加空间距离,pMD18T-S1构建,pMD18T-S1鉴定鉴定:BamHI+EcoRI预期:2680 bp1554bp,pMD18T-S1 BamHI+EcoRI酶切,禽IBVS1基因的克隆和序列分析,IBV S1序列分析,测序：所获序列（略）大小1554 bp，与预期一致，无中止子，含518个氨基酸Blast：99 AY561712.1 （ M41株S1基因）蛋白预测：稳定蛋白等电点8.17，分子量为58.9 kD，在哺乳动物体内半衰期超过30h不含跨膜区没有信号肽,禽IBVS1基因的克隆和序列分析,三. 载体构建,载体构建流程图,顺序选择：S1位于上游S1功能区N端,pcDNA3.1-IgGFc 的构建,pcDNA3.1-IgGFc双酶切:XhoI+ EcoRI预期带:5.5kb1kb,pcDNA3.1-IgGFc 经XhoIEcoR I酶切,表达载体的构建,pcDNA3.1-IgGFcS1的构建,BamHI + XhoI: 5.5kb2.6kbNdeI 酶切鉴定: 800 bp1600bp5600bp,pcDNA3.1-IgGFcS1/BamHI+XhoI,pcDNA3.1-IgGFcS1/ Nde,表达载体的构建,四. 重组载体在Hela 细胞上的表达,一抗：兔抗IBV阳性血清二抗：羊抗兔二抗荧光二抗结果：试验组观察到特异性绿色荧光，对照组无绿荧光表明：IBVS1基因在 Hela 细胞中获得了表达，且有活性,间接免疫荧光检测IBV S1基因在Hela 细胞上的表达,IFA检测IBV S1基因的表达,直接检测IgGFc 的表达,方法：直接免疫荧光二抗：羊抗猪二抗结果：试验组有较明显的绿荧光，而对照组无。表明：IgGFc 基因在Hela 细胞内获得表达，且有活性,直接免疫荧光检测IgGFc 基因在Hela 细胞上的表达,重组载体在Hela 细胞上的表达,斑点杂交检测,方法：Dot-blot（直接和间接）裂解液：都能检测到强烈的阳性反应上清：检测不到阳性反应表明：细胞内表达,产物兼具IBV S1和IgGFc 活性,斑点杂交检测IgGFcS1基因在Hela 细胞上的融合表达A, B: 为直接检测结果 C, D:间接检测结果,重组载体在Hela 细胞上的表达,小结,通过RT-PCR从猪肝脏总RNA中扩增到 IgGFc 基因，并进行测序和序列分析。PCR扩增得到禽传染性支气管炎病毒S1基因 进行测序和序列分析。构建了IBV S1基因和猪 IgGFc 基因融合表达的真核表达载体，并在Hela 细胞上实现了其融合表达。经检测，表达产物主要存在于细胞内，且同时具有IBVS1活性和 IgGFc 活性。,致谢,本论文是