骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究

,骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究,作者：#,#,前言,材料和方法,结论,结果,一 前言,二 材料与方法,三 结果,四 结论,又称为Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴细胞活化因子)，是一种多功能的胞外基质蛋白，表达于多种组织和细胞中；有两种形式：分泌型骨桥蛋白(sOPN)和胞内型骨桥蛋白 (iOPN)；早期研究发现，OPN能够抑制炎症反应的发生，但在不同的环境中OPN的作用可能会表现出不同的侧重。,骨桥蛋白(OPN),研究背景,累及全消化道的一种特发性肠道炎症性疾病；病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用；研究发现，OPN在炎症性肠病患者发炎的肠道组织中的表达增加。,炎症性肠病（IBD）,对患者会产生何种影响？,问题,一 前言,二 材料与方法,三 结果,四 结论,研究目的,（1）采用 IBD 小鼠模型实验观察 OPN 缺失对小鼠自发性结肠炎的影响,（2）研究骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中的作用,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,研究对象,临床症状,临床评分标准,体重下降超过5%,脱肛,腹泻,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,对IL-10 KO 和 OPN/IL-10 DKO 小鼠的临床症状表现进行评分。出现该临床症状计1分，否则为0。合计得出总分。,肛周粘液分泌物,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,患结肠炎小鼠结肠组织切片微观分析,基因表达定量分析,荧光原位杂交技术（FISH）检测分泌的磷蛋白1基因编码区OPN,酶联免疫吸附法量化上清液中TNF-、IL-6、IL-12p40含量,小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离,末端限制性片段长度多态性分析,提取小鼠腹腔巨噬细胞分析吞噬作用,肠系膜淋巴结细菌种类的鉴别,统计分析(非参数Mann-Whitney U 检验或Bonferroni校正单向分析),8,7,6,5,4,3,2,1,9,10,小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的准备和刺激,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.提取mRNA（异硫氰酸胍-酚氯仿法）；2.进行反转录（SuperScript II反转录酶）；3.分析互补DNA对GAPDH，IL-6，IFN-，IL-17A和CD11bmRNA的表达（LightCycler 480 System II）；4.目的基因以GAPDH为参照标准。,基因表达定量分析,GAPDH 5-CAA CTTTGT CAA GCT CAT TTC C-3(正) 5-GGT CCA GGG TTT CTT ACT CC-3 (反)IL-6 5-AGT CCG GAG AGG AGA CTT CA-3 (正) 5-ATT TCC ACG ATT TCC CAGAG-3 (反)IFN- 5-AGC TCT TCC TCA TGG CTG TT-3 (正) 5-ATC TGGCTC TGC AGG ATT TT-3 (反)IL-17A 5-TCT CTG ATG CTG TTG CTG CT-3 (正) 5-CGT GGA ACG GTT GAG GTA GT-3 (反)CD11b 5-GCT CCG GTA GCATCA ACA AC-3 (正) 5-AGT GAA TCC GGA ACT CGT CCG-3 (反),引物序列,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠股骨和胫骨骨髓中提取骨髓细胞；2.含10%热灭活的胎牛血清，100mg/ml链霉素，100mg/ml 青霉素和40ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子RPMI1640培养液中37C培养5天；3.衍生的巨噬细胞按5105个细胞/孔接种于6孔培养板，经10ng/ml IFN-隔夜孵化后，用以下刺激物（Pam3CSK4 50 -500 ng/ml、LPS 100 ng/ml、ODN1585500 nM）刺激细胞24h；4.吸取上清液-80冷冻保存备用。,小鼠骨髓巨噬细胞的准备和刺激,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠结肠组织切片，PBS冲洗；2.含5 mM EDTA 和1 mM二硫苏糖醇汉克平衡盐缓冲液中去除上皮细胞；3.含0.5 mg/ml 胶原酶D、0.5 mg/mlDNA酶I、3 mg/ml DispaseII PBS中用37摇床孵育30分钟慢速旋转，弃上清用40%的Percoll分离液重悬，80% Percoll分离液覆盖；4.离心后即可在两层Percoll液的界面上获取LPMCs，PBS洗涤5.LPMCs中提取RNA,小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠盲肠置于含100 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 9.0)、40 mM 乙二胺四乙酸、4 M 硫氰酸胍 0.001% 溴麝香草酚蓝的溶液中，分解悬浮物中的粪便，提取粪便DNA；2.5-FAM-labeled 516f 和1510r 作引物从粪便DNA中生成16 s rRNA扩增子，10 U of Bsl l 处理3小时，ABI PRISM 3130xl基因分析仪进行分馏；3.OTUs分析13 bp长度末端限制性片段，得到T-RFLP文件，进行主成分分析。,末端限制性片段长度多态性分析,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠腹腔注射3mL4%巯乙酸，第4天获取腹膜渗出细胞。去除红细胞，使用抗CD11b磁珠选择CD11b阳性thioglycollate诱导的腹膜巨噬细胞(TEPMs)；2.TEPMs按2.5105个细胞/孔接种于96孔培养板，经含40 ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640中隔夜孵化，PBS清洗，在这些孔中，分别增加重组OPN浓度1, 10, 100, 1000 ng/ml，细胞在37C培养；3.在活细胞成像溶液中用荧光粒子稀释,用荧光酶标仪在指定时间测量荧光强度。4.所有实验孔中，通过减弱阴性对照孔平均荧光强度评估吞噬活性,小鼠腹腔巨噬细胞的提取和吞噬作用分析,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.在无菌条件下获得MLNs，提取细菌DNA；2.通用引物(27F； 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3, 1492R；5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3)扩增细菌的16s rRNA，内引物(35F；5-CCT GGC TCA GGA TGA ACG-3；519R；5-ATT ACC GCG GCK GCT C-3)扩增巢式PCR；3. 1%琼脂糖凝胶电泳扩增产物，用QIAEX II凝胶萃取设备提纯，绑定到PCR4-TOPO载体，使用TOPO-TA克隆工具将其转变为E. coli TOP10 细胞;4.TempliPhi系统扩增16S rRNA基因，用作DNA测序模板。ABI 3730 DNA分析仪进行分析，从日本DNA数据库中对应所有条目，BLAST分析检查所有的核苷酸序列，用DNA序列分析软件进行匹配。,肠系膜淋巴结细菌种类(MLNs)的鉴别,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,OPN KO小鼠没有出现自发性结肠炎,OPN KO小鼠直肠组织HE-染色剂图像,WT小鼠和IL-10 KO小鼠直肠组织OPN基因的表达,IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠临床得分随时间的变化情况,OPN缺失导致IL-10 KO小鼠结肠中合成OPN mRNA增多,OPN/IL-10 DKO小鼠表现出结肠炎症状,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,IL-10 KO 和 OPN/IL-10 DKO小鼠组织学得分变化情况（左）和4周龄直肠组织HE-染色剂图像（右）,4周龄 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠结肠组织IL-6、IFN-和IL-17A基因表达,OPN/IL-10 DKO小鼠很快发生结肠炎，而在4周龄发生免疫细胞浸润增多和显著的直肠上皮增生,OPN/IL-10 DKO小鼠结肠组织中促炎性细胞因子的基因表达比IL-10 KO小鼠多,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,4周龄的WT、IL-10 KO和 OPN/IL-10 DKO 小鼠直肠组织OPN mRNAFISH图像,IL-10 KO小鼠直肠组织合成OPN mRNA更多,4周龄IL-10 KO小鼠直肠组织OPN mRNA FISH图像(红) E-cadherin免疫荧光染色(绿),IL-10 KO小鼠结肠上皮细胞OPN的合成增多,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,3周龄IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠粪便样本T-RFLP数据,主要成分分析T-RFLP 数据,IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠肠道细菌组成有明显差异,OPN/IL-10 DKO小鼠有更低丰度的梭状芽孢杆菌亚群XIVa和更高丰度的梭状芽孢杆菌XVIII,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,IL-10KO 和 OPN/IL-10 DKO小鼠结肠组织CD11b 基因表达,刺激物刺激WT、OPN KO、 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠产生BMDMs细胞因子数量,IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO 小鼠 LPMCs中NOS2, TNF-, and IL-12p40基因的表达,OPN能影响巨噬细胞的活动,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,WT、OPN KO、 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠在E. Coli 荧光共轭粒子作用后 TEPMs 荧光强度的变化情况,OPN KO小鼠在E. Coli 荧光共轭粒子作用TEPMs荧光强度的变化情况,OPN能影响巨噬细胞的吞噬功能,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,3周龄IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠肠系膜淋巴结细菌种类,相比IL-10 KO小鼠，OPN/IL-10 DKO