《有机质谱中科院》PPT课件.ppt

第一章质谱 1 1有机质谱仪1 1 1离子化方法1 1 2质量分析器类型1 2离子结构的确定1 2 1质谱 质谱基础1 2 2亚稳离子动能谱 MIKES 1 2 3碰撞诱导解离 CID 1 2 4用MI和CID谱来确定离子结构1 2 5离子的热化学1 3质谱裂解机理1 3 1自由基和电荷中心引发的反应1 3 2重排反应1 3 3特征碎片离子1 3 4影响离子丰度的因素 1 4各类化合物的裂解特征1 4 1烷烃 环烷烃1 4 2烯烃1 4 3炔烃1 4 4芳香烃1 4 5醇和苯酚1 4 6醚1 4 7醛 酮1 4 8酯1 4 9羧酸1 4 10胺1 4 11含氮化合物1 4 12氯代烷烃和溴代烷烃 引言 质谱学及技术发展的历史 上世纪初 英国物理学家Thomson利用放电方法产生正离子 经磁场作用后 记录其谱线 获得第一张质谱图 并发现氖的两个同位素22Ne和20Ne 1918年美国A J Dempster用电子轰击的方法 记录了离子的质荷比和相对丰度 1919年美国F W Aston制造了第一台精密质谱 并精确测量了50多种元素的同位素及丰度 制出了第一张同位素表 并首次引入 质谱 概念 1942年出现第一台商品质谱仪 标志着质谱学进入一个新的发展阶段 1957年实现了气相色谱与质谱仪的联用 GC MS将质谱法在有机分析中的应用推向一个新阶段 60年代 有机质谱迅速发展 高分辩技术已达到实用阶段 几乎同时出现了化学电离 场致电离 场解吸电离等技术 70年代 生命科学的迅猛发展 给分子量测量的权威工具 质谱提出挑战 将分子量大 热不稳定性的生物分子如蛋白质 多糖等变成气相离子是质谱亟需解决的关键问题 80年代 出现新的 软电离 质谱技术 如电喷雾质谱ESI 基质辅助激光解吸电离质谱MALDI等 使得生物大分子的测定成为可能 同时解决了LC MS及CE MS的接口问题 从而大大拓宽了质谱及其联用技术的应用范围 1906年Thomson获Nobel物理奖1986年Paul获Nobel物理奖1996年Kroto等获Nobel化学奖2002年Fenn Tanaka获Nobel化学奖 质谱技术 Nobel奖 Atfirsttherewereveryfewwhobelievedintheexistenceofthesebodiessmallerthanatoms Iwaseventoldlongafterwardsbyadistinguishedphysicistwhohadbeenpresentatmy 1897 lectureattheRoyalInstitutionthathethoughtIhadbeen pullingtheirlegs J J Thomson 1936 RecollectionsandReflections G BellandSons London p 341 Thefirstmassspectrometer 1856 1940 CambridgeUniversity Cambridge GreatBritain TheNobelPrizeinPhysics1906 inrecognitionofthegreatmeritsofhistheoreticalandexperimentalinvestigationsontheconductionofelectricitybygases NobelLaureate 1906 JosephJohnThomson 1877 1945 CambridgeUniversityCambridge GreatBritainTheNobelPrizeinChemistry1922 forhisdiscovery bymeansofhismassspectrograph ofisotopes inalargenumberofnon radioactiveelements andforhisenunciationofthewhole numberrule massspectrometryofisotopes NobelLaureate 1922 FrancisWilliamAston 1913 1993 UniversityofBonnBonn GermanyTheNobelPrizeinPhysics1989 Forthedevelopmentoftheiontraptechnique QuadrupoleandQuadrupoleiontrapmassspectrometers NobelLaureate 1989 WolfgangPaul 1917 VirginiaCommonwealthUniversityRichmond VirginiaTheNobelPrizeinChemistry2002 forthedevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules Electrosprayionizationofbiomolecules NobelLaureate 2002 JohnB Fenn 1989 ESIofBiomolecules TheapplicationofESItobiomoleculeswasoneofthemostimportantdiscoveriesinmassspectrometryinthelatterpartofthetwentiethcentury 1959 ShimadzuCorporationTheNobelPrizeinChemistry2002 forthedevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules Matrix assistedlaserdesorption ionization MALDI NobelLaureate 2002 KoichiTanaka 1923 CornellUniversity Ithaca NewYork AMSpioneeringaseousionreactions theMcLaffertyrearrangement instrumentation GC MS LC MS MS MS techniques collisionallyactivateddissociation neutralization reionization electroncapturedissociation IRphotodissociationspectroscopy computerdataacquisition reduction andidentification ProbabilityBasedMatching referencedata 600Kspectra andhighresolutionMS MScharacterizationofbiomoleculesandgas phaseproteinconformers Innovators UniversityofMarylandNotableAchievementsBiomedicalApplicationsofMassSpectrometryMechanismsofAcquiredDrugResistanceRapidAnalysisofIntactMicroorganismsbyMassSpectrometry MixtureanalysisbytandemmassspectrometryKineticmethodformeasuringionthermochemistrySurfaceinduceddissociationandion surfacereactionsHybridmassspectrometersEnergypartitioninginiondissociationMatrix assisteddesorption ionizationIontraps simulationsofionmotion miniaturization 质谱是重要的分析工具 应用相当广泛 其特点可以概括为 SensitivitySpeedSpecificityStoichiometry 质谱法与其他主要分析方法灵敏度的比较 快速 几分钟完成一次测试 直观性好 提供分子量信息 结构信息 碎片离子 高分辨质谱可以提供元素组成 分子式 适用性广 气体 液体 固体 混合物可以通过色谱 质谱联用功能及串联质谱功能分离鉴定 应用范围宽 分析化学的各个领域 可以有效地与多种色谱技术联用 如GC MS LC MS CE MS等 自身的串联MSn 破坏性分析 需汽化 电离 仪器较昂贵 复杂 第一章质谱 什么是质谱 质谱是按顺序记录各种质荷比 m z 离子相对丰度的谱图 质谱含有样品分子或原子的质量信息 质谱图可以给出大量的结构信息 因此质谱图是化合物的一种化学指纹图谱 丙酮的EI质谱图 1 1质谱仪器介绍 离子化方法 电子轰击电离化学电离二次离子质谱ESIMALDI 电子轰击电离 ElectronImpact 电子轰击电离使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子 使其电离 在电子轰击电离中 样品分子M受到一定能量的 如70eV 的电子轰击后 生成分子离子M 有机化合物的电离能在10eV左右 所以M 具有很高的过剩能量 还可能进一步碎裂 产生碎片离子F 等 这些离子在离子源中被加速电压 Vacc 加速后具有一定的动能 M e M 2eM F N A B N 计算 对于动能为70eV的电子 穿过直径为10 1A 10 10m 的分子需要多长时间 提示 电子的m 9 1 10 31kg1eV 1 6 10 19J 电子在如此短的时间内 10 16s 使分子电离 显然 电离速度比振动速度 10 13 10 14s 快2 3个数量级 在发生电离过程中 分子内原子核间距来不及发生改变 因此 电离过程遵守Franck Condon原理 电离过程可借势能图解释 a 和 b 是两种具有代表性的双原子分子及其分子离子的势能图 a 中 分子离子与中性分子的能量最低点对应的核间距相等或十分接近 电离生成的M 处于振动基态的几率最大 这个电离过程需要的能量被称为分子的绝热电离能IEad 这一情形可用以描述分子失去杂原子上的一个非键电子的电离 b 中 分子离子的能量最低点对应的核间距大于中性分子的核间距 电离生成的M 更多地居于振动激发态 图中 0 4跃迁的几率最大 这个过程需要的能量被称为分子的垂直电离能IEv 分子失去一个成键电子的电离过程对应于这一情形 显然 a 中 IEad IEv b 中 IEad IEv 电离能 IE 和出现能 AE 对于分子M的电离过程 反应 1 的反应热既是该分子的电离能 因此 其中 fH M 和 fH M 分别是M 和M的生成热 M e M 2e 1 IE M fH M fH M 对于分子离子M 的碎裂过程 反应 2 所需的最低能量称为临界能 在质谱仪中 为了能使反应产生的碎片离子F 能够到达检测器 反应的速度必须足够快 这就要求M 离子的热力学能稍高于反应的临界能 这个能量被称为碎片离子F 的出现能 AE 其超出反应临界能一部分称为非固定能 E Er E Eex 过剩能量 是动能释放的来源 M F N 2 AE F fH F fH N fH M Eex 中性分子的生成热已经积累了较多的数据 因此 通过测定分子的电离能 IE M 或离子的出现能 AE F 可以得到相关离子的生成热 fH 注意 为了使测量值足够准确 必须满足以下三个条件 1 除了待测离子外的其他物质的生成热是已知的2 M 的碎裂反应不存在显著的动能位移 kineticshift 3 M 的碎裂反应不存在显著的逆活化能 Er 化学电离 ChemicalIonization 化学电离通过引入大量的试剂气 是样品分子与电子不直接作用 试剂气分子被电子轰击电离后因离子 分子反应产生活性反应离子 这些离子再与样品分子发生离子 分子反应 使样品分子电离 甲烷作为反应试剂 CH4质子亲合能 ProtonAffinity PA543kJ mol甘油 Glycerol PA874 8kJ mol差值 874 8 543 kJ mol 331 8kJ mol 3 4eV 内能 异丁烷作为反应试剂 m z58 iso C4H8质子亲合能 ProtonAffinity PA802 1kJ mol甘油 Glycerol PA874 8kJ mol差值 874 8 802 1 kJ mol 72 7kJ mol 0 75eV 内能 CI反应类型 含氨基化合物 用正离子CI有利有机酸 醇或含卤素化合物 用负离子CI有利 发展趋势 不仅为了获取分子量信息 可用于确定官能团及其位 空间异构体 二次离子质谱 SecondaryIonization 以高能量的初级离子轰击表面 再对由此产生的二次离子进行质谱分析是材料表面分析的一种重要方法 由此基础上发展起来的两种十分相似的电离技术 快原子轰击 FAB 和液体二次离子质谱 LSIMS 在有机质谱中有着重要地位 FAB LSIMS离子源 电喷雾电离 Electrosprayionizatin ESI 样品 质量分析器 M nH n 1 挥发 裂分 2 1 2 准分子离子 ESI方法的主要开拓者是M Dole和J B Fenn等人 ESI于1989年应用于有机质谱 ESI的工作原理是 内衬弹性石英管的不锈钢毛细管 内径约0 1mm 被加以3 5kV的正电压 与相距约1cm接地的反电极形成强静电场 被分析的样品溶液从毛细管流出时在电场作用和辅助气流的作用下形成高电荷的雾状小液滴 在加热的气体作用下 液滴因溶剂的挥发逐渐缩小 其表面上的电荷密度不断增大 当电荷之间的排斥力足以克服表面张力时 液滴发生裂分 产生带电的更小微滴 这些液滴中溶剂再蒸发 此过程不断重复 直到液滴变得足够小 表面电荷形成的电场足够强 最终把样品离子从液滴中解析出来 形成的样品离子通过锥孔 聚焦透镜进入质谱仪分析器后被检测 ESI所能承受的液体流量通常为1 20 l min 向喷雾区引入一股逆向的氮气流可以促进雾状液滴的脱溶剂过程 而在内衬的弹性石英管与金属毛细管之间增加一股同轴的助雾化气流可使液体流量提高到2ml min 这样 可使HPLC与质谱直接联用 另一方面 为了提高灵敏度 采用内径更小的 5 50 m 的毛细管可使液体流量降低至50 l min 喷出的液滴直径可由微米级降至纳米级 因而又被称为纳级喷雾 nanospray 纳级喷雾比常规喷雾的电离效率提高了约两个数量级 检出限可达10 21mol l 尤其适合于具有超高灵敏度和超高分辨本领的FTICR 电喷雾通常要选择合适的溶剂 除了考虑对样品的溶解能力外 溶剂的极性也须考虑 一般来说 极性溶剂 如甲醇 乙腈 丙酮等 更适合于电喷雾 对于水溶液 由于液体表面张力较大 ESI要求的阈电位也较高 为了避免高压放电 可向喷雾区引入有效的电子清除剂或使离子源加热以降低表面张力 ESI在大气压和环境温度下进行 被分析物的分子在电离过程中通常产生多重质子化的离子 图2 14是典型的ESI质谱图 由一簇不同程度质子化的分子离子峰组成 相邻两峰相差一个质子 对于任意相邻两峰 由下列公式计算所含的质子数 n 和样品的分子量 M 非共价键相互作用 分子间相互作用包括 1 静电作用 2 氢键作用 3 范德华力作用 4 疏水作用用ESI 软电离技术 可研究非共价键相互作用ESI是目前最温和 Soft 的离子化技术 用ESI研究非共价键相互作用 用ESI研究非共价键相互作用 Anal Chem 2004 76 211 基质辅助激光解吸电离 Matrix assistlaserdesorption ionizatin MALDI 通过激光束与固体样品分子的作用是其产生分子离子和具有结构信息的碎片 所研究的是结构较为复杂 不易气化的大分子 采用固体基质以分散被分析样品是MALDI技术的主要特色和创新之处 基质的主要作用是作为把能量从激光束传递给样品的中间体 此外 大量过量的基质 基质 样品 10000 1 使样品得以有效分散 从而减少被分析样品分子间的相互作用 基质的选择主要取决于所采用的激光波长 其次是被分析对象的性质 基质的作用基质的作用是吸收激光能量并使被测分子分离成单分子状态 使其发生解吸电离 选择基质时 要求样品应能均匀地分散于基质中 基质应能为样品提供质子 较常用的基质有芥子酸 2 5 二羟基苯甲酸 2 氰基 4 羟基肉桂酸 3 吲哚丙烯酸 蒽三酚等 基质的选择是得到优质谱图的关键 样品制备 基质溶液配制及两者混合后能共同结晶为最好的操作条件 这些因素对灵敏度和分辨率有明显的影响 AdvantagesanddisadvantagesofMatrix AssistedLaserDesorption Ionization MALDI MALDI TOF MS可容忍下列物质的最高浓度 MALDI的应用 蛋白和多肽 PeptidesandProteins 寡聚核苷酸 Oligonucleotides 碳水化合物 Carbohydrate 合成高分子聚合物 Syntheticpolymers 类脂类 Lipids 天然产物 Naturalproducts 生物碱 甙类 甾类等 合成有机物 胰岛素由A B两个肽链组成 人胰岛素 InsulinHuman A链有11种21个氨基酸 B链有15种30个氨基酸 共16种51个氨基酸组成 其中A7 Cys B7 Cys A20 Cys B19 Cys 四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键 使A B两链连接起来 此外A链中A6 Cys 与A11 Cys 之间也存在一个二硫键 Polymers e g PEG4000 Li RO CH2 CH2 O nR 提供的结构信息峰间隔为44表明 聚合物的重复单元为 CH2 CH2 O n C112H128N16O16Zn4MW 2208 金属有机化合物 Angew Chem Int Ed 2003 42 3271 3274 基质 咔啉溶剂 CH3Cl 基质 咔啉溶剂 CH3Cl C56H64N8O8Zn2MW 1284 43 质量分析器 电磁扇型双聚焦质谱仪飞行时间质谱仪四极杆质谱仪离子阱质谱仪离子回旋共振质谱仪 磁质谱仪磁质谱仪分为单聚焦和双聚焦两种 单聚焦质谱仪只有一个磁场 双聚焦质谱仪除了磁场外 还有一个静电场 双聚焦质谱仪中静电场和磁场的放置顺序有两种形式 1 顺置形式 即静电场在前面 磁场在后面 2 反置形式 即磁场在前面 静电场在后面 反置形式除了与顺置形式有相同的功能外 还具有一些独特的功能 可做MIKE谱 该构型是最重要的质谱 质谱串联结构之一 1 扇形磁场和电场在离子源中被加速的离子垂直射入扇形磁场中 在洛仑兹力作用下作圆周运动 如图示 所受到的向心力和离心力平衡 所以 结合 1 2 式得出 其中 B和r分别是磁场强度和离子运动轨道半径 3 式表明 磁场是质量分析器 当r固定后 离子的质荷比 m z 与磁场强度平方成正比 而与加速电压成反比 若将Vacc固定 扫描磁场则可检测出样品中不同m z的离子 将离子垂直射入由一对半径分别为r1和r2的同轴扇形柱面电极组成的静电场中 离子作半径为re的圆周运动 受到的电场力与离心力平衡 所以 将 1 式代入上式 得 式中 E为电场强度 当此值一定时 加速电压的改变将导致离子的运动轨道半径的改变 因此 电场是能量分析器 在双聚焦仪器中 电场E与加速电压维持一定的比例关系 调整E使之与加速电压匹配 可使在离子源中产生的所有离子通过并被检测 对于亚稳离子在无场区产生的碎片离子 可通过扫描电场E检测到 以后将涉及到 定义 有两个高度相等 质量分别为M1和M2的峰正好分开 则质谱仪的分辨本领定义为 严格地讲 式中M M1 M2 2 M M2 M1 对于磁质谱来说 所谓正好分开就是按照国际上统一规定10 谷的定义 两峰重叠后形成的谷高为峰高的10 时 认为这两峰正好分开 磁质谱分辨率定义 10 谷 高分辨质谱的优点 四极杆与离子肼质谱仪四极杆质谱仪的分析器称四极质量分析器 Quadrupolemassanalyzer 其工作原理与扇形磁场截然不同 扇形磁场靠离子动量的差别而把不同质荷比的离子分开 而四极质量分析器是靠质荷比不同把离子分开 因而 四极质量分析器又称四极滤质器 离子在四极质量分析器中运动 其运动方程及其求解都较复杂 这里仅就其工作原理简述如下 四极分析器由四根平行电极组成 在一对电极上加电压U Vcos t 另一对加上电压 U Vcos t 其中 U是直流电压 Vcos t是射频电压 由此形成一个四极场 四极杆质量分析器 由一组平行放置的四根金属棒构成 用陶瓷绝缘 交错地联结成两对 加以方向相反的直流 DC 和射频 RF 电压 加速粒子进入分析器 并按m z和RF DC值开始以一种复杂的形式振荡 稳定振荡的离子通过打拿极射到倍增器上被放大记录 不稳定振荡的离子打到四极杆上被中和 从而达到质量分离目的 当质荷比为m e的离子沿z轴射入四极场时 其运动方程为 这是典型的Mathieu方程 其解十分复杂 所代表的物理意义可由以a q为坐标的曲线表示 a q值在稳定区内的离子产生稳定振荡 顺利通过四极场到达检测器 a q值在非稳定区的离子因产生不稳定振荡而被电极中和 当一组质荷比不同的离子进入由DC和RF组成的电场时 只有满足特定条件的离子作稳定振动通过四极杆 到达检测器 其他离子均作不稳定振动而与四极杆相撞 不能通过四极杆 图1 7为四极质量分析器分别分析m z 100 10 1000时的截面图 特别要说明的是三个例子都是在DC和RF组成的电场完全相同的情况下进行的 但只有m z 100的离子能够跑完全程到达检测器 其它离子都被滤掉了 所以 质谱图能够通过扫描RF场而获得 对于一台四极质谱仪 其场半径r 为固定值 也选为定值 若以a q U V 常数对V进行扫描 可使一组不同质量的离子先后进入稳定区而被检测 显然 a q比值越大 扫描成的斜率越大 在扫描线上稳定区内的质量范围越窄 仪器的分辨率越高 四极分析器可以自身串联 构成串联质谱仪 如Q1 q Q2 其中 q是一个只有射频电压的碰撞室 Q1和Q2是两个分析器 它还可以与其它质量分析器串联 构成杂化型串联质谱仪 以综合利用各种分析器的特点 离子阱质谱仪的分析器是由一对环形电极 ringelectrode 和两个呈双曲面形的端电极 endcapelectrode 组成 在环形电极上加射频电压或再加直流电压 上 下端盖电极接地 如图示 离子肼中心至上下端电极距离为Z 至环电极内侧为r 离子肼中离子的运动 可以由Mathieu方程给出 式中各物理量的含义分别由下式给出 Mathieu参数a和q很重要 它们决定了离子运动是否稳定 可以用az和qz为坐标的稳定性图来表示 图中 有若干相互交叉的曲线 称为等 线 从左到右的曲线是从0 1的等 z线 从上到下的曲线则是从0 1的等 r线 处于稳定区的离子 即是 r z 0 1的区域 处于此区域的离子 在r方向或z方向的运动振幅均不大 能长期贮存于离子肼中 稳定区周域以外是不稳定区 处在不稳定区的离子 由于在r方向或z方向的运动振幅过大 会与环电极或端电极碰撞而导致消亡 上图中的m1 m2和m3分别表示三种离子在质量选择喷射时的 az qz 坐标 m1表示已经喷射出去并被检测的离子 m2表示正好处在喷射口的离子 m3表示仍然留在肼中的离子 当U 0 即此时不加直流电压 由qz的表达公式及上图可知 固定 的射频 当逐渐增加V时 qz会随之增加 一旦到达qz 0 908 即图中m2所在位置所对应的qz值 时 离子进入不稳定区 由端盖电极上的小孔排出 因此 当V逐渐增高时 质荷比从小到大的离子逐次排出并被记录而获得质谱图 这就是离子肼进行质量扫描的原理 除此之外 离子阱还可以贮存离子 当不加直流电压时 qz 0 908的离子均贮于离子阱内 可根据需要选择感兴趣的某一质荷比的离子贮存于离子阱内 进行时间上的MSn操作 四极离子肼可直接在肼中使样品电离 也可使用外部离子源 前者是在一个端电极上置一微孔 灯丝发射的电子由此进入阱中使样品分子电离 后者将在离子源中产生的离子注入肼中进行分析 采用外部离子源可使四极离子阱在分析上得到更广泛的应用 例如 采用ESI电离源 离子阱可与HPLC联用 用于生物大分子的结构研究 飞行时间质谱仪 Time of flight TOF 飞行时间质谱仪始于20世纪40年代 但由于当时电子技术和仪器设计的落后 仪器分辨率很低 很难推广使用 到80年代末 Hillenkamp等发明了基质辅助激光解吸电离的新方法之后 将这新的电离方法与飞行时间质谱组合成一种新型仪器 基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱 MALDI TOF 使飞行时间质谱的应用迈进了一个崭新的时代 把测定分子量的范围扩展到几十万原子质量单位 u 在一般情况下 MALDI TOFMS的灵敏度达到10 15mol量级 准确度达到0 1 0 01 的水平 因而 飞行时间质谱仪便成为生命科学领域中重要分析工具 在多肽 蛋白质 糖 核苷酸 高聚物的分析中得到广泛应用 C60及其衍生物 稀土元素络合物 金属络合物及某些挥发性很低非极性及分子量较大的有机化合物 用有机质谱测试很难得到信号 而用MALDI TOF MS测试 则可以得到非常理想的谱图 飞行时间质谱分线性及反射模式两类 经典的线性飞行时间质谱包括EI电离源 圆筒式飞行管 检测器和记录系统三部分 性能较好的商品仪器既有线性模式也具有反射模式 其装备简图如图示 飞行时间质量分析器 飞行时间质谱仪的工作原理 在离子源中产生的离子经电压Vacc加速后获得的速度为 经过长度为L的漂移管到达检测器 离子的飞行需要的时间 可以看出 质荷比大的离子飞行速度越小 到达检测器的时间也越长 质荷比小的离子先到达检测器 在通常情况下 离子的飞行时间为微秒数量级 飞行时间质谱首先要考虑的问题是如何使离子在被注入漂移区后既无空间发散又无能量发散 如果相同质量的离子在不同时间离开离子源或存在能量发散 分辨率将大为下降 解决办法之一是采用离子反射技术 使不同动能的离子得到聚焦 如图示 在经过漂移管后 离子进入减速反射区 动能较大的离子在该区中进入较深 存在运动惯性 反射过来所需的时间也较长 这使动能较小的离子可以赶上 因此 经过反射 质量相同而动量不同的离子可以同时到达检测器 PrincipleofMALDI TOF 2 EnergyFocussingbytheReflectron m1 m2 E1 E2 飞行时间质谱仪分辨率的定义定义 其中 M是拟确定的质量 M是半峰高时的峰宽 线性模式 分辨率较低 反射模式 分辨率较高 可高达15 000 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 FT ICR MS 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪的分析器是由一对激发电极 一对检测电极和一对收集电极组成的池子 cell 置于稳定的超导磁场中 磁场垂直于收集电极 在磁场中 分析池内的离子会在垂直于磁场的平面中做回旋运动 各种离子的回旋运动频率为 假设在激发电极上加一个高频电信号 其频率与某一个质荷比离子的回旋运动频率一致 则这个离子将吸收高频电信号的能量 因而这个离子的运动速度加快 回旋运动的半径逐渐加大 图1 12 停止高频电信号后 该离子将以较大的固定半径作回旋运动 由于该离子离检测电极较近 因而检测电极被感应而产生高频电信号 下页图 这个信号被检测 其频率和该离子的回旋运动频率相一致 由公式 1 就可计算出该离子的质量 但必须指出 由于FTICR MS是用特定波形的高频电场 把共振池中某段质量范围的离子同时激发到回旋运动轨道上 并以各自的回旋频率作运动 因此 在检测电极上感应出不只一种频率电信号 而是多种频率电信号的叠加 必须再用傅立叶变换技术 快速将时域谱变换成频域谱 按公式 1 可以由频率换算成质量数 从而获得各个离子的质量及其丰度 即常见的质谱图 BasicexperimentalsequenceforFTMS FTICR MS的分辨率定义分辨率通常是商品仪器的主要性能指标 但不同种类仪器 分辨率定义涵义有所不同 FTICR MS的分辨率 FullWidthatHalfHeight FWHH 按下式定义 其中 m 某一离子的质量 m 半峰高的峰宽 图1 15是EI条件下 测定全氟三丁胺 PFTBA 的m z131峰的分辨率高达100多万 其中 m 0 00012Da 高分辨ESI谱图 高分辨离子回旋共振质谱仪 ICRMS 能把多电荷离子的同位素峰分开 从而容易确定各个峰的电荷数 HumanGrowthHormon intact FTMSSpectrum FTICR MS的特点超高分辨高测量准确度可以实现时间串联MSn可以在池内进行离子 分子反应等 1 2离子结构的确定 串联质谱是通过对选定m z离子反应产物的分析 对目标化合物进行结构鉴定或断裂机理等方面的研究 此法不须预先色谱分离 适合复杂混合物体系分析 1 2 1串联质谱基础 二级串联质谱 以MS MS或MS2表示 若要深入了解离子 包括分子离子和碎片离子 的性质及其反应机理 仅仅取得常规质谱数据是远远不够的 须结合串联质谱技术得到进一步的结构信息 M 和F 离子的分解反应通常都有许多竞争的反应通道 因此 常规质谱记录的是所有这些连续和平行反应的总和 串联质谱与色谱 质谱这两种技术的相似性 串联质谱通常用MS MS或者MSn表示 质谱仪一般只能作纯物质的定性分析 对于混合物样品 需要采用GC MS或LC MS 然而 MS MS装置可以在某种范围内进行混合物的直接分析 串联质谱A 空间串联B 时间串联 时间串联质谱仪是用同一个质量分析器在不同时间进行串联质谱实验 如 FT ICR 傅里叶离子回旋共振 和IT 离子阱 这两种仪器的工作原理并不相同 但进行MS MS实验的程序颇为相似 都包括以下步骤 电离 选择离子 激发前体离子 最后检测产物离子 1 2 2亚稳离子动能谱 Mass analysedionkineticenergyspectrometry MIKESorMI 1 2 3碰撞诱导解离谱 Collisionally induceddissociation CID P F N前体离子碎片离子中性碎片亚稳反应 前体离子P 不与任何粒子 包括中性分子 离子 电子或光子等 进行能量交换 属单分子过程 被称为亚稳离子 MetastableIon MI 的解离反应 在观察亚稳反应时 发生反应的场所必须处于严格的高真空状态 一般来说 亚稳离子的碎裂反应通道相对较少 只有那些活化能较低的才能被观察到 碰撞诱导解离反应 前体离子P 被活化后发生的分解反应 称为碰撞诱导解离反应 Collision inducedDissociation 最常用的离子的活化方式是向反应区内引入一种惰性气体 使其与离子发生碰撞 在这个过程中 离子的部分动能被转变为内能 然后再发生单分子分解 通常碰撞诱导解离反应可以获得更多的反应信息 P N P F N 离子的活化还可以通过与 激光 光子或电子束的作用来实现 并被称为光致解离 photodissociation PD 和电子轰击激发 electronimpactexcitationofIonsoforganics EIEIO 另一种较为特殊的方式是使离子直接碰撞到固体表面上 这种技术被称为表面诱导解离 surface induceddissociation SID 亚稳谱和碰撞诱导解离谱是最常用也是最重要的串联质谱方法 对于感兴趣的离子 同时获得其亚稳谱和碰撞诱导解离谱是很有意义的 通过比较这两种谱 通常可以得到有关不同反应通道活化能相对大小的信息 反置双聚焦质谱仪 VBE系统 是最具代表性的串联质谱系统 用磁场B将感兴趣的离子选择出来 第二无场区中反应的产物离子由静电场E分析 例如 P 是我们感兴趣的离子 首先 选择适当的磁场强度将M 选择出来 研究P 的反应 由上式可以看出 P 产生碎片离子F 注意 F 是在P 离开离子源后 也就是在飞行过程中产生的 所以它仍然保持前体离子M 的运动速度 即它们的动能与其质量成正比 因为静电场是离子的动能分析器 所以扫描静电场便可得到M 的所有产物离子 当反应是没有靶气时 即在亚稳方式 这种技术被称为质量分析离子动能谱 MIKES 有靶气时 称为碰撞诱导解离谱 CID 几个基本概念 1 离子的飞行时间及寿命在通常使用的EI质谱条件下 离子在离子源中停留大约为1 5 s 当离子离开离子源经加速电压加速后 其运动速度为 根据公式 1 进入磁场和电场 离子的运动方向虽然发生偏转 但其速度不变 离子经过一定距离L到达检测器 所需要的时间t可通过下式计算 例如 一台双聚焦质谱仪 从离子源出口到检测器的距离为2m 质量为100u的一价离子经8kV的加速电压加速后到达检测器所需要的时间是多少 提示 1u 1Da 1 66 10 27kg 1eV 1 6 10 19J 离子到达第二无场区所需的时间约为这个时间的一半 在与此相似的仪器参数下 质谱中的反应在10 s这个量级的时间内完成 亚稳离子亚稳离子隐含着分子离子与碎片离子 或碎片离子与碎片离子之间的亲缘关系 测定亚稳离子可对质谱解释 质谱碎裂机理研究及分子结构 离子结构的确定 提供可靠的 确定的实验依据 双聚焦质谱仪 在EI操作条件下 70eV电子轰击样品 样品分子将产生分子离子M 这些分子离子具有范围很宽的内能 或热力学能 它们的分布用几率函数P E 来描述 具有内能不同的M 以不同的反应速率进行单分子分解反应 反应几率用速率函数k E 来描述 图7 1是Wahrhaftig图 它表明单分子离子分解时P E 和k E 的关系 现假定M 可以发生两种不同的分解反应 当M 的内能 或着稍大于临界活化能E AD 时 M 无法发生碎裂反应或者碎裂反应速率常数k 105s 1 这时 大多是以M 离子的形式被检测 当M 的内能 Es AD 时 具有的反应速率常数k 106s 1 它们将在10 6s或更短的时间内形成碎片离子 即碎片离子AD 和AB 大多是在离子源内形成 当Em AD M 的内能 Es AD 时 具有的反应速率常数k在105 106之间 寿命在10 5 10 6s之间 这些M 在飞行途中的无场区发生碎裂反应 这时的M 称为亚稳离子 记作m M AD AB 在离子源中产生的AD 和AB 离子 当它们离开了离子源 进入加速区时 都会得到一份完整的动能 其数值与M 的动能相同 亚稳离子m 所具有的动能只有按质量所占的分额分配的那部分 即由于M 发生分解反应时 部分内能转换成动能 亚稳离子的峰具有不同程度的扩散 因此峰较宽又很弱 其质心位置不易准确测定 上述三种性质离子的反应速率常数分布曲线见下图 从热力学角度来定义上面提到的三种离子 不稳定离子的热力学能较高 其相应的反应速率常数k 106s 1 所以这些离子往往在离开离子源之前就已经裂解成碎片离子了 稳定离子的热力学能较低 在分解反应临界能以下 其反应速率常数k 104s 1 这些离子可以完整地到达检测器而不发生分解 亚稳离子的热力学能介于上面的两种离子之间 在分解反应临界能以上一个很窄的范围内 其热力学能宽度约为0 5eV 其反应速率常数104 k 106s 1 亚稳离子不一定具有与初始态离子相同的结构 这是因为离子的结构与其热力学能有关 因此 MI谱给出的是分解离子终态结构的特征反应 一般来说 亚稳离子的碎裂反应通道较少 只有那些活化能较低的才能被观察到 如一些简单碎裂反应和重排反应 为了获得更多的反应信息 串联质谱可以采取多种措施使热力学能较低的稳定离子活化后发生分解 最常用的方法是向反应区引入惰性气体 如He 使其与离子发生碰撞 在这个过程中 离子的部分动能被转变为热力学能 激发态的离子可能分布到许多不同能级 然后再发生单分子分解 这种技术被称为碰撞诱导解离 在碰撞活化以后发生解离的终态离子所具有的热力学能范围很宽 可达3 4eV CID谱给出的是稳定离子的结构 3 动能释放和亚稳峰形状亚稳离子在碎裂过程中 将一部分过量的热力学能转变为动能释放出来 导致产物离子的动能展宽 这一过程称为叫做动能释放 在质心坐标上 产物离子的溅射是各向同性的 当这种溅射方向与离子的质心运动方向一致时 产物离子获得额外动能 E 当方向相反时 产物离子的动能则减少 E 这样 离子的动能范围增加了2 E 动能释放来源于两个方面 一是高出反应活化能的那部分非固定能E 另一方面则来自反应的逆活化能Er 即T T Te 从产物离子动能谱的峰宽能够计算出碎裂过程释放出来的能量 采用不同的仪器方法时 计算T的方法稍有不同 当采用MIKES谱分析单电荷离子的解离反应时 用峰的半高宽计算T0 5 其中 WM 和WF 分别是主束离子和产物离子的半峰宽 mM mF 和mN分别是主束离子 产物离子以及中性碎片的质量 Vacc是加速电压 动能释放不仅影响峰宽 有时还使峰形改变 当T很小时 峰形接近高斯形 而当T很大时 典型的峰形有平顶峰或碟形峰 三种类型的亚稳峰形状 一般来说 简单键断裂被认为没有逆活化能 非固定化能是动能释放的唯一来源 T0 5 10 20meV 而重排反应在大多数情况下 有较大的逆活化能 相应地 反应的动能释放也较大 因此 在推测离子结构和反应机理时 动能释放能够提供极有说服力的证据 例如 上面反应的的亚稳峰是一个复合峰 由两个不同形状的峰叠加起来的 其中 高斯形峰的T0 5 0 05eV 而碟形峰的T0 5 0 67eV 这表明反应同时通过两个途径进行 一个经历四元环过渡态 另一个经历五元环过渡态 前者由于明显的环张力可能形成碟形峰 而后者则可能对应于高斯峰 将苯环上的两个邻位以氯取代后 高斯形峰消失了 这表明上述推断是正确的 因此 动能释放对于推测反应机理具有重要意义 1 2 4用MI和CID谱来确定离子结构 MI和CID谱是质谱中用来确定离子结构 通常是异构体离子结构 最常用和最有效的方法之一 两谱提供的主要信息是 MI CID谱反应 通道 离子丰度比 MI谱亚稳峰的形状动能释放值 碎裂与重排反应热力学在质谱中 离子的碎裂与重排是一对竞争反应 在通常情况下 碎裂反应是否发生可以从质谱图直接判断 但是 重排反应是否发生则较能作出正确判断 这是因为碎裂反应产物具有不同质量 而重排反应产物的质量没有变化 碎裂和重排反应的竞争取决于这两个反应活化能的相对大小 离子的反应及其活化能 上图是离子反应的一个典型的势能面 离子A 碎裂和重排反应的活化能分别为Ea和Ei 当E Ei 离子是稳定的 既不发生碎裂也不发生重排 当Ei E Ea 离子不可能碎裂 但能异构化为B 当E Ea 离子的碎裂反应才能观察到 因此 图中I区是稳定离子 II区是可以异构化但不分解的离子 III区是发生分解的亚稳离子 MI谱给出的III区亚稳离子的结构 碰撞诱导解离技术是使热力学能较低的稳定离子 I和II区 受激跃迁到各种高能级 所以 CID谱给出的是 I和II区 稳定离子的结构 离子结构的确定因为异构体的存在而变得复杂 离子的碎裂和重排反应的活化能可以构成多种不同的反应势能面 见下图 在讨论四种不同情形的反应时 A 均是初始离子 而B 则是其异构体 a 中 A 离子异构化反应的活化能 Ei 远大于其碎裂反应临界能 Ea 即通道1的能量 当发生分解的离子热力学能较低时 如在亚稳离子区域 异构化反应不能进行 当发生分解的离子热力学能较高时 如经碰撞活化后 异构化反应可能发生 但其反应过渡态的态密度相对较低 反应发生的速率很小 因此 A 和B 两种异构离子的MI和CID谱是可以区分的 b 中 Ei低于A 和B 两者的碎裂反应临界能 Ea和Eb 因此 离子在发生碎裂的过程中不可避免地要经历异构化反应 其终态结构是A 和B 的混合物 MI谱和CID谱在一定程度上包含两个异构体的贡献 在这种情况下 A 和B 各自所占的比例则取决于离子在发生分解时所具有的热力学能 由于B 的碎裂反应的最低活化能比A 的低 在MI谱中 B 的反应占一定优势 而在CID谱中 初始离子A 的反应所占比例将明显增加 这是因为CID过程观察的是处于势能阱中的稳定离子 如果Ei不是太小 在质谱反应所需的时间范围内 A 和B 之间不可能达到平衡 因此 这两个离子的MI谱和CID谱都有一定的区别 如果Ei很小 如 c 则A 和B 离子无法区分 对应于这种情形的经典例子是C4H8 异构离子 C4H8 的亚稳反应表明 这些离子具有相似的产物离子丰度比和亚稳峰形状 见表1 2 说明这些离子在发生亚稳反应之前已经异构化为一个共同的结构 或者是它们的混合物 Thefollowingmetastabledissociationsofthemolecularions 1 6 generatedbyEIwerestudied C4H8 C4H7 H C4H8 C4H6 H2 C4H8 C4H5 H H2 C4H8 C3H5 CH3 C4H8 C3H4 CH4 C4H8 C2H4 C2H4 1 2 3 4 5 6 表1C4H8 亚稳分解反应的产物离子相对丰度 表2C4H8 亚稳分解反应的动能释放值 以上数据表明 C4H8 离子之间的异构反应活化能一定低于分解反应临界能 当离子的热力学能低于分解反应活化能时 离子可以自由地相互转换 freelyinterconvert 使得它们的MI谱很相似 d 所示的是一种颇为特殊的反应势能面 离子A 碎裂的最低活化能 Ea 远高于其重排活化能 Ei 而Ei又高于异构体B 碎裂的最低活化能 Eb A 必须先重排为B 再从B 发生断裂 而B 重排为A 的逆过程不发生 在这种情况下 重排过程由于有较高的活化能 是速率控制步骤 亚稳的A 离子重排为B 后 高能量的碎裂通道 如通道4 可以观察到 而起始结构即是B 的亚稳离子只能通过低能量通道碎裂 CH3CH O CH3和C2H5O CH2这一对异构体的分解是这种情形的最典型的例子 这两个 氧鎓 离子可分别由如下反应制备 C2H5OC2H5 CH3CH2 O CH2 1 CH3CH3OCH CH3 2 CH3O CH CH3 2 CH3 离子1和2亚稳分解反应的产物离子相对丰度 可以看出 离子 1 的两个反应通道中 以失去H2O分子的反应的活化能最低 但其反应速度随内能变化而变化的幅度很缓慢 log10kvs Ecurve的斜率小 而失去C2H4分子的反应需要的活化能较高 但当离子的热力学能相对较高时 如1FFR 该反应的反应速度随内能上升较快 与第一个反应形成竞争反应 尽管失去CH2O分子的反应是直接断裂反应 但由于活化能较高 在亚稳观察的窗口内 不能看到该反应的发生 有关上述结论的能量数据是通过实验测量和理论计算得到的 如 通过测量C3H5 和CH2