《氨基酸纸层析》PPT课件.ppt

2020 3 24 1 实验一氨基酸纸层析 2020 3 24 2 1 通过氨基酸的分离 学习并掌握纸层析的原理和操作技术 2 掌握分配层析法 3 掌握影响分配系数的因素 一 实验目的 2020 3 24 3 层析技术 chromatography色谱技术 一 发展史 层析分离技术在20世纪初就已得到应用 1903年用于植物色素的分离 各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开 由此得名为 色谱法 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱 HPLC 2020 3 24 4 二 定义层析技术是根据被分离的混合物中各组分的理化性质 分子的形状和大小 分子极性 吸附力 分子亲和力 分配系数等 的不同 使各组分在两相 一相为固定的 称为固定相 另一相流过固定相 称为流动相 中进行分配 层析的基本概念 2020 3 24 5 固定相 固定相是层析的一个基质 它可以是固体物质 如吸附剂 凝胶 离子交换剂等 也可以是液体物质 如固定在硅胶或纤维素上的溶液 流动相 在层析过程中 推动固定相上待分离的物质移动的液体 气体等 都称为流动相 柱层析中一般称为洗脱剂 薄层层析时称为展层剂 层析的基本概念 2020 3 24 6 三 层析技术的种类1 按流动相的状态分类 1 液相层析 色谱 2 气相层析 色谱 2 按固定相的使用形式分类 1 柱层析 2 纸层析 3 薄层层析 3 按分离过程所主要依据的物理化学性质分类 1 吸附层析 2 分配层析 3 离子交换层析 4 凝胶层析 5 亲和层析等 2020 3 24 7 纸层析法 是以滤纸作为惰性支持物的分配层析 滤纸纤维上羟基具有亲水性 因此吸附水作为固定相 通常把有机溶剂作为流动相 将样品点在滤纸上 进行展层 样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配 由于它们的分配系数不同 不同氨基酸随流动相移动的速率就不同 于是就将这些氨基酸分离开来 形成距原点不等的层析点 二 实验原理 2020 3 24 8 分配层析法 利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同 而达到分离目的的一种实验方法 在一定条件下 一种物质在某种溶剂系统中的分配系数 是一个常数 2020 3 24 9 溶剂系统 正丁醇 甲酸 水 15 3 2固定相 水和滤纸纤维素有较强的亲和力 因而其扩散作用降低形成固定相 流动相 有机溶剂和滤纸亲和力弱 所以在滤纸毛细管中自由流动 形成流动相 由于混合液中各种氨基酸的 值不同 所以移动速率 即迁移率Rf值 就不同 从而达到分离的目的 2020 3 24 10 移动速率 比移值 原点到层析点中心的距离Rf 原点到溶剂前沿的距离 2020 3 24 11 影响Rf值的主要因素 Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比 由于在同一实验条件下 两相体积比是一常数 所以主要决定于分配系数 不同物质分配系数不同 Rf也就不同 1 物质的结构和分子极性 物质的结构不同极性不同 在两相中的溶解度也就不同 物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配系数 极性大的易溶于水中即固定相中 Rf小 反之 Rf则较大 2020 3 24 12 2 层析溶剂 首先 溶剂的纯度要高 其次 溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0 05 0 85 再次 溶剂系统必须新鲜配制 如正丁醇 甲酸 水系统久放易引起酯化 3 pH值 溶剂 滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离 从而影响物质的极性和溶解度 使Rf改变 2020 3 24 13 4 滤纸 层析滤纸由高纯度棉花制成 要求滤纸要清洁 质地均一 厚薄一致 纤维松紧度适中 具有一定的机械强度 要被溶剂所饱和 不同型号的滤纸 其厚薄程度 纤维松紧度各不相同 因此 滤纸纤维结合水的量不一样 两相的体积比也就不同 Rf也不同 另外 滤纸的杂质也会影响Rf 必要时进行预处理 可用0 01 0 4M的HCl处理除去金属离子 2020 3 24 14 5 室验室的温度和时间 温度影响物质在两相中的溶解度 即影响分配系数 也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积 也影响溶剂系统的含水量 即影响流动相的组分比例 层析必须在恒温条件下进行 2020 3 24 15 6 展开方式 上行法Rf小 下行法 层析缸上部有一盛展开剂的液槽 滤纸点样端向上进入槽中 重现性差 斑点易扩散 Rf大 环行法 最好用无方向性的特制滤纸 用圆形滤纸层析时 由于内圈较外圈小 限制了溶剂的流动 Rf较小 7 样品溶液中杂质 如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值 2020 3 24 16 1 实验材料 谷氨酸 组氨酸 脯氨酸 亮氨酸标准品2 仪器 1 毛细管 2 电热吹风机 3 层析缸 4 层析滤纸 5 小型玻璃喷雾器 6 铅笔 直尺等 3 试剂 1 氨基酸标准溶液 亮氨酸 脯氨酸 谷氨酸 组氨酸标准品 2 溶剂系统 正丁醇 甲酸 水 15 3 2 体积比 摇匀 3 显色剂 0 25 的茚三酮丙酮溶液 三 实验材料 仪器和试剂 2020 3 24 17 1 样品的准备 称取谷氨酸 组氨酸 脯氨酸 亮氨酸标准品各1mg混合溶于10 异丙醇中 0 01M 2 滤纸的准备 取一长方形滤纸 在滤纸横向对应的两边 距边沿2cm处 各画两条平行线 一条作前沿标志 一条作点样线 在点线上每隔2cm画一个 作为点样位置 共5个点 四 实验步骤 2020 3 24 18 2020 3 24 19 3 点样 用毛细管点样 中间点混合氨基酸 两侧点四种标准氨基酸 每个 每点一次用晾干后再点下次 点样点的直径应控制在2mm左点样点重复点5次右 点样完毕用大头针将滤纸做成筒形 点样面向外 2020 3 24 20 2020 3 24 21 2020 3 24 22 4 展层 向层析缸中加入层析溶剂 液面不要超过点样线 高约1 5cm 约50ml溶剂 将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中 将层析缸密闭 待溶剂到达标志线后取出冷风吹干 5 显色 用喷雾器将0 25 茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上 热风 加快反应 反应吹干显色 2020 3 24 23 五 实验结果与计算 1 用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来 2 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离 计算各种已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值 3 分析混合样品中未知氨基酸的组分 2020 3 24 24 2020 3 24 25 六 思考题 1 分析影响分配系数的因素有哪些 2 何谓分配层析法 分配系数 3 茚三酮丙酮溶液的作用机制 七 思考题答案 1 答 质量比和pH都有影响 当萃取剂浓度 组成 水相成分以及温度等改变时 分离系数就要发生变化 2020 3 24 26 七 思考题答案 2 答 利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同 使之分离 被分离物质在两相中都能溶解 但分配比率不同 展层时就会形成以不同速度向前移动的区带 指一定