《氧化葡萄糖酸杆菌》PPT课件.ppt

氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans 裴承强 1 氧化葡萄糖酸杆菌简介2 1 3 二羟丙酮的代谢途径及相关酶类3 气升式生物反应器发酵生产二羟丙酮4 氧化葡萄糖酸杆菌膜结合乙醇脱氢酶的应用和性质5 代谢工程技术在微生物产DHA中的应用 简介氧化葡萄糖酸杆菌 是一种专性好氧的革兰氏阴性菌属于醋酸杆菌科 对人和其它动物无病原性 但可引起水果的细菌性腐烂和褐变 该菌种含有多种酶类能不完全氧化有机物 产生多种重要化合物 这使得氧化葡萄糖酸杆菌在工业应用中占有一席之地 其酶类主要有两大类 第一种是颗粒酶 结合在细胞膜上 如D 葡萄糖脱氢酶 甘油脱氢酶 D 山梨醇脱氢酶等 这些酶为黄素蛋白类或者细胞色素 第二种存在于胞质中 催化胞内碳水化合物的代谢 1 3 二羟丙酮 DHA 的代谢途径和参与酶G oxydans代谢甘油产生DHA主要有两条氧化途径 1 不需要ATP和辅酶因子NAD 甘油可被细胞膜上的甘油脱氢酶一步直接氧化成DHA 电子传递链与ADP氧化磷酸化形成ATP的过程相耦合 当细胞中糖酵解途径及三羧酸循环途径缺乏时 这条途径可为细胞生长及其他代谢过程提供所需的能量 2 甘油进入细胞后 在细胞质中甘油脱氢酶的作用下生成DHA 然后在二羟丙酮激酶作用下转变为磷酸二羟丙酮 DHAP 或者甘油在磷酸激酶作用下磷酸化成甘油 3 磷酸 Glycerol 3 P 然后经细胞质内甘油 3 磷酸脱氢酶作用转变成DHAP 再进入磷酸戊糖循环途径 这一过程需要ATP 也需要辅酶因子NAD 微生物中的甘油脱氢酶 Glyceroldehydrogenase GDH 按照其依赖辅酶的情况可划分为3种类型 1 依赖NAD 的GDH EC1 1 1 6 主要存在于细胞质中 它将甘油转化为DHA后 DHA进一步磷酸化 进入糖酵解和三羧酸循环途径 为微生物生长提供能量 2 GDH EC1 1 1 72 EC1 1 1 156 需要以NADP 作为辅酶因子 这类GDH大多存在于霉菌和动物组织中 可将甘油氧化为DHA或甘油醛 3 GDH EC1 1 99 22 既不依赖NAD 也不依赖NADP 主要存在于葡萄糖酸杆菌属 氧化葡萄糖酸杆菌 弱氧化葡萄糖酸杆菌等 的细胞膜上 气升式生物反应器发酵生产二羟丙酮 气升式反应器不需机械搅拌 而是利用两个区域间流体静压力的不同来使液相循环 其优势是高位液体循环 高效热量传递 低剪切力 低能量损耗 低维护费用 获得具有高活性甘油脱氢酶的静息细胞优化培养基的成分 5 6g L酵母浸出液 4 7g L甘油 42 1g L甘露醇 0 5g LK2HPO4 0 5g LKH2PO4 0 1g LMgSO4 7H2O 2 0g LCaCO3 pH4 9 膜结合乙醇脱氢酶的应用和性质 应用 乙醇脱氢酶可参与全细胞催化1 2 丙二醇生成D 乳酸性质 此酶由两个亚基组成 其表观相对分子质量分别为80000和50000 其催化条件及特性 最适反应温度是30 最适pH值在5 5 6 0之间 该酶能催化短碳链的一元 二元醇 随着碳链长度的增加 催化活性减小 大多数金属离子及抑制剂 Cu2 Fe3 Ca2 EDTA等 对此酶都有抑制作用 代谢工程技术在微生物产DHA中的应用 国内外学者将代谢工程技术应用于微生物生产DHA的研究工作主要包括两个关键方面 1 过量表达甘油脱氢酶基因 改善微生物细胞已有的代谢网络 分别利用强启动子tufB和gdh使G oxydans膜系脱氢酶sldAB基因过量表达 不但提高了菌体生长的密度 还明显提高了DHA浓度和转化率 2 将甘油脱氢酶基因在模式宿主菌中表达 构建新的代谢途径或拓宽菌株的底物利用范围 针对目标产物的不同 我们可以对菌株进行改造 以达到我们想要的结果 如 获得高产量的二羟丙酮 就可以设计乙醇脱氢酶缺陷突变株 使得甘油脱氢酶超表达 重建载体的主要过程 1 设计寡核苷酸引物 2 获得GDH基因 3 PCRGDH基因 4 酶切PCR合成片段 5 由T4DNA连