第八章 化学毒物的致突变作用

第七章 化学毒物的生殖毒性,第八章 化学毒物的致突变作用,第一节 概 述,一、 基本概念遗传是生物保持其种族特性的根本；变异是生物物种推陈出新的来源。,一、基本概念,突变：遗传物质发生的可改变生殖细胞或体细胞中的遗传信息，并产生新的表型效应的改变。突变类型：自发突变和诱发突变。致突变作用：外源化学物及其他环境因素引起核内遗传物质发生变化，并且这种改变随细胞分裂过程而传递的过程。,一、基本概念,突变,基因突变,染色体畸变,染色体结构异常,染色体数目异常,光镜观察。,根据表型判断；,二、遗传学基础,（一）DNA-基因-基因组；（二）染色质与染色体1. “舒展以复制，浓缩以分离”；2. 染色体与基因密切关联。（三）体细胞与生殖细胞,二、遗传学基础,（四）细胞周期与细胞分裂,有丝分裂（mitosis）,减数分裂（meiosis）,第二节 化学毒物的致突变类型,一、基因突变基因突变：组成一个染色体的一个或几个基因中DNA序列发生的变化，又称点突变。突变类型：碱基置换、移码和大段损伤。,一、基因突变,（一）碱基置换碱基置换：某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。突变类型：转换和颠换。突变的后果：同义密码、错义密码或终止密码。,一、基因突变,（二）移码移码：DNA中增加或减少了一对或不等于3的倍数的几个碱基对所造成的突变。,一、基因突变,（三）大段损伤大段损伤：DNA链大段缺失或插入，这种损伤有时可跨越两个甚至数个基因。突变类型：,基因A,a,b,小缺失：,插入：,重排：,b,a,a,b,二、染色体结构异常,突变原因：染色体或染色单体断裂，当断端不发生重接或错误重接。检查方法：光镜检查相应细胞有丝分裂中期的染色体。,染色体化学断裂剂,拟紫外线断裂剂：,拟放射性断裂剂：,复制后,复制后,复制前,染色体结构异常类型：断裂、倒位、缺失、重复、易位、环状染色体等。三、染色体数目异常,第三节 化学毒物致突变作用的机理及后果,一、以DNA为靶的损伤机理（一）DNA加合物及交联分子的形成许多化学诱变剂或其活性产物是亲电子剂，极易与核酸或蛋白质等大分子的亲核位点发生共价结合，形成加合物或交联分子。例1. 黄曲霉毒素B和苯并（a）芘经代谢活化形成环氧化物，然后与DNA共价结合生成加合物，从而诱发突变。例2. 烷化剂的诱变作用。,烷化剂的诱变作用：,烷化剂：是一些可与大分子亲核部位共价结合的亲电子剂，通过提供烷基与DNA 共价结合而诱发突变。如，硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯。例如，鸟嘌呤的O -6 位被烷化常引起碱基错配，由原来的G:C转换为A:T。,烷化剂的诱变作用：,烷化剂既可以是单功能的，也可是多功能的。前者与DNA中一个亲核基团共价结合；后者有两个或更多活性基团，每一分子可与DNA的两个或多个部位结合，也称交联剂（cross linker）。交联剂可使DNA链内、链间或DNA与蛋白质之间发生交联，而引发突变。,（二）碱基类似物的替代,原理：一些碱基类似物可在DNA复制时掺入并与互补链上的碱基配对，这些类似物掺入后常常发生酮式和烯醇式的互变异构，在复制子代DNA时引起配对性质的改变，从而造成碱基替代突变。碱基类似物：5-溴尿嘧啶（BU）、2-氨基嘌呤（2-aminopurine, AP）。,5-溴尿嘧啶（BU）的替代：,5-BU（酮式）:A； 5-BU（烯醇式）:G；,A T,掺入,A BU,复制,A T,G BU,复制,G C,A T,T A,G BU,（三）嵌入剂的诱变作用,一些平面分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间，称为嵌入剂。例如吖啶橙、原黄素、吖黄素等吖啶类染料分子。若嵌入到新合成的互补链中，将使之失去一个碱基；嵌入到模板链的两碱基之间，就会使互补链插入一个多余的碱基。这些改变将引起移码突变。,嵌入剂的结构：,（四）碱基的损伤,一些诱变剂可以修饰碱基的化学结构，改变其配对性质而引发突变。例如，亚硝酸、羟胺、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍。含有NH2的碱基（A、G、C）都可以被亚硝酸损伤发生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，造成碱基转换突变。,亚硝酸引发的突变机制：,将引发 C G T A 的转换。,二、不以DNA为靶的损伤机理,（一）对DNA合成或修复酶系统的作用例如，诱变剂可对DNA聚合酶、错配修复酶等与DNA合成或修复相关的酶系统作用，形成加合物，可以间接导致DNA损伤，从而引发基因突变或染色体畸变。,（二）对纺锤体的毒作用,1. 与微管蛋白二聚体结合微管蛋白二聚体是构成纺锤纤维的材料。秋水仙碱、鬼臼素等能与该蛋白的特定位点结合，抑制微管的组装，从而引起细胞分裂完全抑制。2. 与微管上的-SH结合铅、锌、汞、砷等可与微管蛋白上的-SH结合，而引起细胞分裂的部分抑制。,（二）对纺锤体的毒作用,3. 破坏已组装好的微管细胞中，微管经常与游离的二聚体处于聚合与解聚的平衡状态。微管结合蛋白（MAP）可使二聚体聚合，维持微管的结构与功能。灰黄霉素、秋水仙碱等能与MAP结合，导致组装好的微管解聚。,（二）对纺锤体的毒作用,4. 妨碍中心粒移动中心体是一种与微管装配和细胞分裂密切相关的细胞器，一般由一对相互垂直排列的中心粒和周围的无定形物质构成。秋水仙碱能防碍有丝分裂早期两对中心粒的分离和移向两极，从而造成染色体数目的异常。,三、突变的后果,化学诱变剂引起的突变后果,体细胞突变,生殖细胞突变,基因突变,染色体畸变,遗传易感性改变、遗传性疾病、致死性突变。,染色体病、死胎、自发流产等。,不影响下一代，产生肿瘤、畸形、动脉粥样硬化、糖尿病、衰老等后果。,影响人类基因库质量,三、突变的后果,遗传病：个体生殖细胞或受精卵的遗传物质发生突变所引起的疾病，通常具有垂直传递和终生性的特征。基因库：人群生殖细胞内所具有的能遗传给下一代的全部基因的总和。（基因组：个体所具有的全部基因）。,第四节 化学毒物致突变作用的研究方法,一、常用的致突变试验（一）细菌回复突变试验细菌回复突变试验是以营养缺陷型的突变体菌株为对象，观察受试物能否引起其发生回复突变的方法。又称Ames试验。常用菌株:组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型大肠杆菌。,野生型 ：生物群体中观察到的最高频率的表型，或具有这种表型的系统、生物和基因 (即正常型)。正向突变：改变野生型性状的突变。回复突变：突变体经过第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的基因型和表型。,（一）细菌回复突变试验,代谢活化系统：,S9混合液（10%）的组分：,磷酸盐缓冲液 KCl 溶液 MgCl2 溶液 葡萄糖-6-磷酸钠溶液 NADP+ 溶液 肝S9液,肝S9液：多氯联苯诱导的大鼠肝组织匀浆，经9 000g离心得到的上清液，主要成分为肝细胞微粒体。,（一）细菌回复突变试验,试验方法：,点试验法,平板掺入法,测试菌株S9，缺乏组氨酸,测试菌株+受试物 S9，缺乏组氨酸,一般先用点试验法作预实验，平板掺入法是标准试验方法。,受试物点于滤纸片上,（二）小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变实验,原理：哺乳动物基因突变试验主要采用啮齿类动物或人的培养细胞进行正向突变试验。常用的方法有：小鼠淋巴瘤（L5178Y）细胞胸苷激酶位点（tk）突变检测；中国仓鼠卵巢（CHO）细胞及中国仓鼠肺（V79）细胞次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点（hgprt）突变检测。,（二）小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变实验,（二）小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变实验,（三）微核试验,微核是染色体的无着丝粒片段或整条染色体在细胞分裂后期，不能进入子代细胞核中，而在子代细胞的间期胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞核着色一致但体积小。微核试验用于检测染色体断裂剂及非整倍体诱变剂。,小鼠骨髓多染红细胞微核试验原理：,当成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为多染红细胞，然后成为正染红细胞进入外周血中。在主核排出时，微核可留在胞浆中，并维持一定时间。观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂剂和纺锤体的损伤情况。,小鼠骨髓多染红细胞微核试验原理：,骨髓,血液,成红细胞,多染红细胞,正染红细胞,（四）染色体畸变试验,制备中期分裂相染色体标本，光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也称为细胞遗传学试验。染色体畸变试验可进行体内试验，也可进行体外试验；可进行体细胞的分析，也可进行生殖细胞的分析。,（五）程序外DNA合成试验,原理：正常细胞一般仅在间期的S期进行DNA的复制合成，称为“程序性DNA合成”。 当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在S期以外的其他时期，称为“程序外DNA合成”。,（五）程序外DNA合成试验,方法：用无精氨酸的培养基将细胞阻断于G1期，并用药物（羟基脲）将正常的DNA半保留复制阻断。然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸苷的培养液中培养。如果受试物损伤了DNA，并启动了DNA损伤修复合成， 3H-胸苷就会掺入到DNA链中，利用放射自显影测定DNA的放射活性，即可了解受试物对DNA链的损伤情况。,（六）果蝇伴性隐性致死试验,原理：利用果蝇的眼色性状是由X染色体上的基因决定，并与X染色体的遗传相关联的特征来观察X染色体上基因的突变情况。主要用于雄性生殖细胞遗传损伤的分析。,B：棒眼， b：圆眼； Bb：肾形眼。 W：红眼， w：杏眼。,（六）果蝇伴性隐性致死试验,P：, X w X w（杏色棒眼）,B,B,二、致突变试验注意事项：,（一）体外试验的活化系统大鼠肝原代细胞； S9混合液。S9混合液的特点：优点： S9可活化大多数前致突变物；缺点：对通过其他方式活化的前致突变物，S9不适用； S9中的亲核物质可能会影响试验的敏感性。,二、致突变试验注意