疟疾镜检培训片

保山市疟原虫镜检培训李加全2014年8月12,目 录一、疟原虫的生活史二、疟疾防治简述三、疟原虫镜检所用材料四、染液的配制五、血片制作六、血片染色七、疟原虫读片八、疟原虫计数,一、疟原虫的生活史在按蚊体内的有性生殖 孢子生殖 恶性疟原虫的一个卵囊可产生和释放出大约1000个子孢子在脊椎动物宿主体内进行的无性内繁殖，即裂体生殖。 包括了在红细胞内的发育周期，即红细胞内裂体生殖和在肝脏实质细胞内的发育周期，称红细胞外裂体生殖，又称组织期。,迟发型子孢子,速发型子孢子,红外期裂殖体,红外期裂殖子,雄配子体,雌配子体,裂殖体,大滋养体,裂殖子,雄配子体,雌配子体,合子,动合子,卵囊,子孢子,疟 原 虫 生 活 史,人体内,按蚊体内,肝细胞内,红细胞内,休眠体,被吞噬,雄配子,雌配子,环状体,2.2 子孢子（sporozoite）形成,呈梭形，1015m1m主动从卵囊壁钻出或因卵囊破裂后散出，随血淋巴钻入蚊体组织只有到蚊唾腺内的子孢子才具有传染性,迟发型子孢子 1980年发现周期均属间日型的复发性疟原虫种。即人的间日疟原虫和卵形疟原虫，还可能有一些猴疟原虫，它们的子孢子可以分化为休眠子或发育的组织型裂殖体，两者的比例，取决于不同的株。在相当长的一段时间休眠子停留在肝细胞内呈休眠状态，只有一个核，直径4-5微米。在预定的时间又开始生长进行红细胞外裂体生殖，形成裂殖子浪潮入侵到血内而产生临床复发。其它更多的休眠子以同样方式可造成进一步复发，复发类型取决疟原虫的种和株的不同。有人建议把这两类子孢子命名为“速发型子孢子” 和“迟发型子孢子”，不过我们还无法从形态上来区分这两种类型的子孢子。推测后一种类型的子孢子先发育为休眠子，在发育成组织内裂殖体前要蛰伏89个月。,恶性疟原虫和三日疟原虫（或类似的猴或猿的疟原虫）尚无真正复发的证据，因为它们的子孢子不会分化为休眠子，而只在肝内进行正常的迅速发育的红细胞前裂体生殖。,配子体的形成 经过生成几代裂殖子后，有些裂殖子遂分化为有性体，即配子体。成熟后可感染按蚊，造成传播。,疟原虫的分类 疟疾的致病微生物称为疟原虫(Malaria Parasites)，疟原虫是一种单细胞动物，它在动物界的分类是原生动物门，质子亚门，孢子纲，晚孢子亚纲，血孢子目，疟原虫科，疟原虫属；在真核原生生物界的分类位置属于原虫亚界，顶复门，孢子虫纲，球虫亚纲，真球虫目，血孢子虫亚目，疟原虫科，疟原虫属。疟原虫这一名词只限于球虫目中血胞子虫亚目的疟原虫科，包括爬行类、鸟类、哺乳类血中所发现在各种疟原虫。疟原虫科的寄生虫都要进行两种繁殖方式，在脊椎动物宿主体内进行的无性繁殖即裂体生殖及在蚊子体内进行的一次有性生殖即孢子增殖。划分疟原虫属的根据是这类寄生虫均在脊椎动物宿主的肝实质细胞内进行分裂的无性繁殖，即红细胞外裂体生殖。这属寄生虫（特指哺乳类疟原虫）的另一特征是蚊子宿主为各种按蚊。,已发现的疟原虫近120种，其中至少有22种见于灵长类宿主：鼠类、蝙蝠及其他哺乳类有19种。在鸟类和爬行类已描述的疟原虫约70种。灵长类的疟原虫又分作三个亚属，在疟原虫亚属内，根据其在红细胞内的裂体生殖周期和一些其它特征又分成4类。,人们公认的人疟原虫有四种：三日疟原虫 1881年间日疟原虫 1890年恶性疟原虫 1987年卵形疟原虫 1922年,每一种疟原虫，又可依其潜伏期、复发间隔、对药物敏感性、对按蚊的易感性、致病力和宿主对疟原虫的免疫力等分为若干株或亚种。株与株之间在形态上无明显差异，但在生物学上有明显不同；例如间日疟原虫有长潜伏期和短潜伏期的区别。有的却判别葚微，例如同是对氯喹产生抗性的恶性疟原虫，往往因发现这种疟原虫的地区不同和抗性大小，而命名为不同的株。 我国经过多年的防治，现在最常见的是间日疟原虫，其次为恶性疟原虫，三日疟原虫已经很少，蛋形疟原虫则基本消失。 根据很多学者研究证明，间日疟在我国有长潜伏期和短潜伏期两种类型，也有形态上和间日疟原虫有差异的多核亚种；而恶性疟原虫有很多抗药虫株，有的只对一种抗疟药有抗性，而有的对两种或两种以上抗疟药有抗药性。三日疟和蛋形疟还未发现有变种或株。,病例,治疗病人 喷洒灭蚊 预防服药 病例搜索宣传教育,疫点处置,疑似病例 临床诊断病例 确诊病例,治疗病人疫点处置流动人员管理,主动病侦察,血检,二、防治简述,三、疟原虫血检所需的 材料 75%酒精、采血针、推片、载玻片、甲醇、滴管、刻度管、蒸馏水、染液、香柏油、二甲苯、显微镜、血检登记本、擦镜纸等。,四、常用血膜染色剂的配制,常用染液的配制法 伊红和美蓝及天青的水溶液必须分甲、乙两缸分装，以免伊红与美蓝离子在水溶液中结合而产生沉淀，失去染色力。伊红化美蓝或天青可以溶解于无水甲醇（或乙醇）里，在密闭瓶中可贮存相当长的时间而不失效，主要原因是甲醇能使伊红化美蓝重新离解而发挥染色作用。,罗氏染液甲 液 美蓝（医用） 10.00克碳酸钠（纯） 0.50克 蒸馏水 1000.00毫升将溶液置于温箱（37）中数日，使溶液呈深 紫色时即可使用。乙液 伊红（水溶性） 1.00克蒸馏水 1000.00毫升,吉氏染液原液配制 吉氏染剂粉 1 克 甘油（中性） 50 毫升 纯甲醇（无水） 50 毫升 将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。然后转入烧瓶内，置5560恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，13周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配 好后要密封，放置越久染色性能越好； 工作液临时配制： 将吉氏原液用pH6.87.2的PBS作1:151:20稀释混匀即可。,瑞氏染液 瑞氏染剂粉 0.2 克 甲醇 100.0毫升 甘油 3.0毫升 将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入玻塞瓶中摇匀后待用。,J、S、B染液 甲液: 美蓝（医用） 0.5克 1%硫酸 30.0毫升 重铬酸钾 0.5克 磷酸氢二钠 3.5克 蒸馏水 500.0毫升 将美蓝溶于蒸馏水中，缓慢加入1%硫酸搅动，使之均匀。再加重铬酸钾至呈紫色沉淀即成。然后加入磷酸氢二钠并予搅动，沉淀溶解后倒入烧瓶中煮1个小时，待美蓝溶液变深紫色时，即可使用。 乙液: 伊红（水溶性） 1.0克 蒸馏水 500.0毫升 将伊红加入蒸馏水中，充分搅动至完全溶解即可。,费氏染液 甲液: 美蓝（医用） 0.8克 天青I 0.5克 磷酸氢二钠（无水） 0.5克 磷酸二氢钾（无水） 6.25克 蒸馏水 500.0毫升 乙液: 伊红（水溶性） 1.0克 磷酸氢二钠（无水） 5.0克 磷酸二氢钾（无水） 6.25克 蒸馏水 500.0毫升 先配制磷酸盐液，然后加染剂粉，将天青I放进乳钵中，并加入少量磷酸盐液，经研磨使之溶化。经24小时后，过滤，分别贮于染色缸中，备用。如乙液变绿时，即应更换。,四、血片的制作,用光学显微镜检查疟原虫，目前还是诊断疟疾和鉴别疟原虫种类的可靠方法，也是疟疾防治工作中的一项常规技术。,玻片的清洁 玻片是否清洁对涂制血膜的质量有直接关系，因此检查疟原虫用的玻片要求干净、明亮、无油脂、无水渍和无棉花纤维，新旧玻片都要清洗去污脱脂后才能使用。 1洗衣粉洗涤法 用洗衣粉配制成约5%水溶液煮开后，逐张放入玻片，浸泡1-2小时，用毛刷轻刷玻片两面，经清水反复冲洗干净后、再用开水浸泡，待开水稍冷后用无油脂的毛巾或脱脂纱布逐片擦干备用。有条件的地方，可把擦好的玻片浸泡于95%的酒精中2小时，使玻片脱酯后再擦干备用。 2清洁液洗涤法 主要用于新玻片的洗涤，用过的玻片，应先用洗衣粉除去油迹后，再用本法洗涤。,清洁液的配法：重铬酸钾 50-100 克硫酸（工业用） 100 毫升水 1000 毫升,先把硫酸慢慢放入水中，然后加重铬酸钾，待凉后盛于有盖玻璃缸中，将玻片逐张放入耐酸的网袋内，再将网放入清洁液，浸泡2小时后，提起网袋移入清水中，流水冲洗。 新玻片的处理，用1-10%的稀盐酸浸泡24小时（处理存在的游离碱），用清水反复冲洗，再用中性洒精浸泡，晾干后即可使用。,血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是将血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平铺在玻片上面。,取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机，但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；36-48小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多，恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。,取血方法 采血部位一般人为耳垂、指头，婴儿可在足跟取血，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病），先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季应用手指捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1-2毫米。不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。 制作大批血膜标本时，可从静脉取血，一人迅速滴血，一人或多人推片。为了防止凝血，可适当转动注射器尽快滴血或加极少量抗凝剂（500单位肝素/毫升双蒸水），每2毫升血可加0.01毫升即可。如滴血与推片者动作协调、迅速，最好不用抗凝剂，以免红细胞表膜着色深易形成“镶边”的状态。这样做涂片间日疟大滋养体伪足消失变圆，恶性疟配子体可缩成球形，甚至逸出红细胞外，故只宜用作抗原标本，不宜作教学和示范之用。,取血量及涂片法 薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另1张边缘平滑（最好为磨石边缘）的载玻片做推片。用推片一端边缘的中点从取血部位取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25-30夹角，待血液向两侧扩展到约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约制成2.5厘米长）。推片时两载玻片形成角度过小则血膜过薄，过大则血膜厚。中途切勿停顿。制成的血膜要求血细胞分布均匀，无裂缝，整个血膜成舌形。,厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2-1圈，涂成直径 0.8-1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。,涂制厚、薄血膜的位置 通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载玻片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用，厚血膜涂在第3格，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。 作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个。 门诊检查的血片一般每片1人，可涂两个厚血膜一个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查； 疟疾调查时，每张玻片可涂制4-6人的厚血膜。,血膜编号 血膜制成后，一般用铅笔在已干燥的薄血膜上编号；疟疾调查的血膜在制作前先用特种蜡笔或用玻璃墨水在反面写上血膜的代号或受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。书写在玻璃上的墨水配制： 碱性复红 10 克 95%酒精 100 毫升 鞣酸 20 克 蒸馏水 80 毫升 将碱性复红溶于酒精中成酒精复红饱和溶液（在室温内2-3天后才能溶解），鞣酸与蒸馏水配成20%水溶液，然后将两种溶液各半配在一起即成。,制作血膜的注意事项,1玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载玻片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜易产生空白区，厚血膜脱落。作推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一至。 2刚涂制的血膜平放标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧；晾干血膜时应注意防尘、防昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜血红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。 3血膜应让其自然干燥，不能用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜，夏天标本尽可能在24-48小时内固定染色；冬天也不超过72小时，放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差，若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1-3分钟）；厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严。长期贮存则需放干燥器中，再放入冰箱保存，用时将干燥器放在室温（25左右）中1-2小时后，再取出血片染色，此法可保存3年，无冰箱的区、乡卫生院可将薄血膜先用甲醇固定，再将干燥的厚血膜溶血干燥后亦用甲醇固定，再放入石灰缸中保存。,五、血片的染色,固定和溶血 血膜固定前必须充分晾干，尤其厚血膜，否则在染色时易脱落。薄血膜须用甲醇或无水乙醇固定，即用小玻棒蘸甲醇于薄血膜上轻轻抹过，并需注意切勿将固定液沾到厚血膜上。厚血膜固定之前必须进行溶血，可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倾去，晾干后固定染色。通常用吉氏染液大批染色时，厚血膜不需要预先溶血，可直接将干透的厚血膜插入染色架中，或每片之间以小棍相隔捆在一起，直接放入配制好的染液中进行染色。在这个染色过程中，溶血、染色作用同时进行。,取吉氏染液原液，用pH7.07.2的磷酸缓冲液稀释1020倍。厚血膜不需固定，薄血膜先用甲醇固定（如厚血膜在同一张载玻片上，切勿延及厚血膜），干后滴加稀释的吉氏染液，布满血膜（如大批染片，可置入染色缸），染2030分钟，冲洗，晾干后镜检。稀释的染液，宜用时现配，否则易产生沉淀，影响染色效果，大批染片时，应根据染色时的条件，如不同病人的血片，染色时的室温、染液稀释程度、冲洗水的pH值等情况的不同，先试染少量血片，摸索出染色效果最佳的时间和条件，再大批染片。此外，染色时间应随染液稀释情况作适当的调整，染液浓度高，染色时间可短些，反之则长。,常用染液 染色法,吉氏染色 将载玻片有血膜的一面向下平放于染色玻板上，玻片的一端用一竹棍或火柴棒隔开，使载玻片与玻板之间有一空隙，将新稀释的2-4%的染液，用滴管滴于玻片一侧，使染液扩散到空隙中去，以染液充满有血膜处空隙为度，染色20-30分钟后，用蒸馏水或缓冲液轻轻冲洗，晾干镜检。此法可以减少血膜上的染料沉淀和空气中尘埃，保持血膜清洁。也可将染液直接滴在血膜上染2030分钟，到时用水将染液缓慢冲洗掉，切勿先倒掉染液再用水冲洗，否则血膜上沉积的染料沉淀很难洗去。,瑞氏染色 临床上喜欢使用瑞氏染液血膜。它是直接将染液滴在薄血膜及已溶血的厚血膜上，可利用染液中的甲醇使血红蛋白迅速凝固。因此，染薄血膜可以不必先用甲醇固定，但染液切勿沾及厚血膜，否则，血红蛋白凝固是无法检查厚血膜的。其染色步骤是将染液原液直接滴在薄血膜上，使之布满整个薄血膜，约1分钟后加等量的缓冲蒸馏水，轻轻摇动载玻片，使水与染液混匀，然后用玻璃棒将已稀释的染液引到厚血膜上，使厚、薄血膜共同染色5分钟后用水轻轻冲洗，切勿在自来水龙头上直接冲洗血膜，以免厚血膜被冲掉，而应将水滴在薄血膜上，使其缓缓流过厚血膜直至血膜呈现淡紫色为止，晾干后镜检。,罗氏染色 先用蒸馏水按1：19的比例，分别将甲、乙两种染液稀释，再将甲、乙稀释液混合，倒入染缸内，立即把标本插入染缸内浸染，染色1030分钟后，用水冲洗至血膜略呈红色为止，晾干后镜检。,JSB染液染色 先将薄血膜经甲醇固定，厚血膜则不需溶血处理，一同浸入盛甲液的染缸中染30秒钟取出，移入盛酸性蒸馏水（PH6.26.6）的缸中染10秒钟后，浸入盛乙液的缸中染1秒钟，再回到酸性蒸馏水缸中清洗10秒钟，再浸入甲液缸中染30秒，又到酸性蒸馏水缸中清洗10秒钟，使血膜呈紫红色为度，晾干后镜检，此法染血膜十分快速，仅23分钟，且两缸染液皆可使用几个月之久（通常只需换清洗缸中的酸性水），适用于地段实验室及医疗单位化验室作个别病例检验之用，但用于流行病学调查中有大批血片需要染色时，反而显得十分烦琐。,费氏染色 将已固定的薄血膜和已充分干燥的厚血膜一同浸入甲液1秒钟，取出用清水洗数秒种，至血膜上的颜色停止流出为止，再移入乙液中浸染1秒种，最后用清水冲洗12分钟，洗去多余的伊红。晾干后镜检。此法染色时间短，也适宜临床检验。但厚片溶血往往不完全，染色也较差，可使用较薄的厚血膜，或先将厚血膜溶血后再与薄血膜同染。,几种改良染色法,1、瑞氏与吉氏染液复合染色法 单用吉氏或瑞氏染液染色，都感美中不足，前者使细胞浆与中性颗粒着色较淡，后者对胞浆染色较差。为了克服两者的不足，将瑞氏染液用作固定剂先染半分钟，再用稀释好的吉氏染液复染10分钟。本法适宜用于临床检验。,2、吉氏生理盐水染液 染色法 取吉氏染液原液57毫升加0.85%生理盐水（中性的）至100毫升，染色0.51小时，此法可使白细胞及疟原虫着色更为鲜明，被寄生红细胞的薜氏点和西门氏点亦更清晰，色泽保持时间较长。此法适用于制备教学和防治研究用的标本。,3、加皂素处理的吉氏染色法 取3滴溶血用的0.51.0%皂素，置于厚血膜上,转动5秒钟，至皂素液呈淡红色时轻轻倒掉，晾干后再按常规方法染色，也可用1%的皂素液稀释吉氏染液，再按常规方法染色.用皂素处理染色的血膜，背景清晰，无血小板混淆，且着色较深，红细胞残骸极少或没有，疟原虫易于鉴别.此法适用于染教学和长期保存的标本。,4、吉氏染液快速染色法 在已干透的厚血膜上滴蒸馏水12滴，经12分钟后，加吉氏染液原液1滴混匀，染23分钟。倒掉染液将玻片放入清水中浸泡20秒钟，取出后加甲醇1滴于血膜上，褪色2秒钟，立刻用清水冲洗，晾干后镜检。此法快速，适宜门诊检查。,5、成批染色 染剂数量较多的血膜标本，采取成批染色，即可简化手续，又可节省时间，其操作程序如下：,1、固定薄血膜 将血片略倾斜使薄血膜端向下，在薄血膜上端滴12滴甲醇，使其均匀扩散。也可用玻璃棒或滴管沾少量甲醇在薄血膜上括一下，使甲醇涂遍全血膜。 2、厚血膜溶血 在厚血膜干透后滴上23滴蒸馏水，使血红蛋白溶解，经23分钟血膜呈乳白色，即可将水倾去。 3、将血片插入染色缸或用小段竹签（或火柴梗）置于玻片两端逐片隔开，重叠2030张玻片，用橡皮筋（或塑料丝、粗棉线）捆紧。 4、稀释染液 用PH7.07.2的水将吉氏染液配成24%稀释溶液立即倒入染色缸、大标本缸或方磁盘内，染液稀释后不可久放不用，10分钟后染色力可丧失90%。 5、染色 将成捆的血片放入稀释的染液中，染色30分钟左右。 6、水洗 先用中性蒸馏水轻轻冲掉缸中染液，使血片在染缸或大磁盘中漂洗数秒钟再取血片晾干。,6、复染 用于血膜着色不佳或保存过久而褪色的，均可进行血膜复染。其方法如下：,1、用油镜检查过的血膜 先用二甲苯反复洗去油污。 2、用甲醇或1%硼酸液滴于血膜上，让其褪色至血膜不见蓝色为止，约数分钟。 3、中性蒸馏水沿玻片轻轻冲洗数秒钟，待干。 4、用2-4%吉氏染液染色14小时。 5、水冲洗，晾干。,复染的血膜、疟原虫胞浆着色极淡，若在40毫升吉氏染液中加美蓝1克，摇匀后染色，会使着色更佳。 染色时间视血片存放时间的长短、染液浓度、复染时气温的高低而灵活掌握。存放时间久，染色时间适当延长。 若血膜上附着色素颗粒太多，或染色太深，影响镜检时，可用二甲苯去镜油，加1滴75%酒精，立即用中性蒸馏水轻轻冲洗或漂洗数秒钟。也可于洗去镜油后将血片浸入生理盐水中数分钟，即能纠正血膜颜色，洗掉血膜上的沉渣。,影响染色效果的因素,1、染料和溶剂的质量 染料、甲醇和甘油如不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此，新配制的染液在染色前应先测试酸碱度，如发现偏酸或偏碱，应调整适度，并先试染后，再投入使用。 2、染液配制时间 新配制的染液常因原料未充分溶解，一般染色力较弱，且常带碱性。存放时间稍长，染色力增加，尤其以吉氏染液为甚。因此，应于使用前12周配制染液。,3、染液稀释的浓度 染液浓度高，染色快，细胞染色深，薜氏点、茂氏点明显；浓度低染色慢，细胞结构染色均匀清晰，薜氏点、茂氏点显得细小且不易查见。 4、染色时间 染色时间长，化学反应充分，染色效果好。反之染色效果差，外界影响、温度高可加速化学反应，染色时间可略缩短，反之则应适当延长染色时间。 5、稀释用水和冲洗用小的PH值 稀释用水的酸碱度很重要，一般应是中性蒸馏水或冷开水，即PH值为6.87.2为宜，忌用生水，因其常含自由生活原虫，造成污染。,六、疟原虫的 形态和鉴别,薄血膜中的疟原虫形态 薄血片厚度要求使每个红细胞平铺片上，互不重叠。迅速干燥后，疟原虫随着很快被固定。用罗氏多色性染色剂后，核呈鲜红色或紫红色，胞浆呈兰色 ，色素呈黄褐色或深褐色。,形 态,在RBC内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种的重要依据疟原虫基本构造相同-细胞膜、质、核瑞氏Wright或姬氏Giemsa染色：核染成紫红色，胞质呈兰色，疟原虫消化血红蛋白产物-疟色素呈棕黄色疟原虫在RBC内各期形态各不相同间日疟原虫在RBC内的形态:三期六种形态滋养体期：大、小滋养体裂殖体期：成熟、未成熟裂殖体配子体期：雌、雄配子体,虫体胞质较少呈环状，中间为大空泡细胞核位于虫体一侧，颇似戒指的红宝石。早期滋养体又称为环状体。,ring form,红细胞,胞 核,胞 浆,环状体,滋养体期,早期滋养体-环状体,晚期滋养体-大滋养体,经810小时，虫体增大，伸出伪足，胞质增多，出现疟色素红细胞胀大，颜色变淡，并出现能染成淡红色的小点，称薛氏小点。,滋养体充满RBC， RBC变形原虫胞质大，变形，有一大空泡 胞核增大疟色素增多 薛氏小点明显,Trophozoit,胞核,胞浆,疟色素,红细胞,晚期滋养体,红细胞,胞核,疟色素,胞质,未成熟裂殖体Immature Schizont,裂殖体期,经40小时晚期滋养体发育成熟，虫体变圆，空泡消失核开始分裂,2-12 细胞核薛氏小点 受染RBC 变大、颜色苍白、形态不规则,Mature schizont,红细胞,胞核,疟色素,胞质,成熟裂殖体,成熟裂殖体,裂殖子1224个，平均16个，排列不规则虫体占满胀大了的红细胞 疟色素集中成堆,从红细胞释出裂殖子的全过程约需1分钟。在血液中的裂殖子，一部分被吞噬细胞吞噬，一部分侵入健康的红细胞，重复裂体增殖过程。,间日疟原虫配子体,疟原虫经过几次红细胞内裂体增殖，部分裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而发育为雌性配子体或雄性配子体， 间日疟原虫配子体呈圆形或椭圆形，疟色素均匀分布于虫体内，核1个。,间日疟原虫雌配子体,虫体较大，占满胀大的红细胞胞质致密，色深蓝核小致密，深红色，多位于虫体一侧疟色素分散,间日疟原虫雄配子体,虫体较小，胞质浅蓝核大疏松，淡红色，多位于虫体的中央。,Male gametocyte,雄配子体,Female gametocyte,雌配子体,恶性疟原虫-环状体,环纤细,约为RBC直径的1/5核1个，但2个常见红细胞常含2个以上原虫虫体常位于红细胞的边缘 ，呈“鸟飞状”,恶性疟原虫大滋养体,一般不出现在外周血体小结实，圆形，不活动疟色素集中一团，黑褐色原虫此时开始集中在内脏毛细血管,恶性疟原虫成熟裂殖体,裂殖子836个，通常1824个，排列不规则疟色素集中成一团虫体占红细胞体积的2/3至3/4,恶性疟原虫雌配子体,新月形，两端较尖核致密，深红色，常位于中央疟色素黑褐色，分布于核周围,恶性疟原虫雄配子体,腊肠形，两端钝圆胞质色蓝而略带红核疏松，淡红色，位于中央疟色素黄棕色，小杆状，在核周围较多,蛋形疟原虫 滋养体：小滋养体与三日疟相似，核较大，胞浆较粗厚。大滋养体结实，空泡不显著，常呈圆形，极少呈带状，色素棕黄色，颗粒粗大。 被蛋形疟原虫寄生的红细胞，大小正常或稍胀大，褪色，部分红细胞变成卵圆形或边缘呈伞状，可见较多的薛氏点，且比间日疟出现早，于小滋养体期已见到，斑点也较粗大。,裂殖体 与三日疟相似，圆而结实，约占红细胞的3/4，一般不超过正常红细胞大小。成熟裂殖体含裂殖子612个，常为8个，一般排列成菊花状。裂殖子比前三种疟原虫大。,配子体 亦与三日疟相似，一般不超过正常红细胞的大小。,三日疟原虫 滋养体：小滋养体略小于间日疟原虫，核较大，胞浆较粗厚，有时可见色素。大滋养体常呈带状，极少呈圆形，核呈长条状，胞浆结实，一般不含空泡，色素颗粒粗大，深褐色，常沿虫体边缘分布。,薄血膜中四种人体疟原虫形态特征（罗氏染剂染色）,厚血膜中的疟原虫形态,厚血片三种疟原虫形态鉴别（吉氏染剂染色）,小滋养体： 呈环状或因空泡消失而变成各种形状，形状的改变因胞浆向核的一侧，或同时向二侧收缩，或围住核，或环中间有几处断裂开而决定。镜检时常见“！”、“；”、“，”、“飞鸟”、“V”、“断环”和“鸟眼”等。 间日疟原虫小滋养体大于恶性疟小滋养体，核较大，胞浆较厚，常呈“！”、“；”或“，”等。常伴有各期疟原虫。 三日疟原虫小滋养体大于恶性疟而略小于间日疟的小滋养体。核较大，胞浆较粗厚，常呈“，”、“；”或“鸟眼”等。有时可见色素。,恶性疟小滋养体，体积较小。核小，胞浆纤细，常呈“；”、“！”、“飞鸟”、“V”形成“断环”等。如片上有许多这样的小滋养体而无大滋养体，可断定为恶性疟原虫。恶性疟大环状体（大型小滋养体）与间日疟相似，较难区别。此时应依据片上有无其他时期疟原虫来确定。此外，如果血片上只有少数环状体，其形态又不太典型，则应另外取血检查，不可轻易下结论。,大滋养体 间日疟大滋养体阿米巴样运动活泼，空泡大，故形态变化较大，而三日疟大滋养体仅有轻微运动，空泡小，故形态变化较小。 间日疟大滋养体呈阿米巴样或缩成各种形状，常见有些原虫的胞浆缩为圆形，核和色素均被包在中间，着色很深，只能看到深兰色的胞浆和黄褐色的色素折光，核模糊不清，或仅于调节显微镜的亮光时，才隐约可见。有些胞浆皱缩断裂成几个团块，大小不一，互不连接，核位于胞浆之中或外边，色素分布不匀。有些则仅见胞浆和色素而核看不清楚。,三日疟大滋养体常呈圆形或卵圆形，带状者罕见。由于它的胞浆结实，色素颗粒粗大，深褐色，数量较多，以致整个原虫呈黄绿色，核不太清楚。 恶性疟大滋养体，几乎与薄血片一样，常呈圆形，体小结实，色素细小，金黄色，结成团块后，呈黑褐色。,裂殖体 三种疟原虫的裂殖体前期及裂殖体，除虫体略有缩小而着色较深外，几乎与薄血片一样。 间日疟裂殖体较大，而恶性疟和三日疟均较小。 三日疟裂殖子较大，间日疟次之，恶性疟较小。,配子体 间日疟和三日疟的配子体相似，均呈圆形，但前者比后者大。间日疟小配子体，核大，圆形或星状，胞浆较少，着色淡，色素粗大，数量较多。间日疟大配子体与成熟大滋养体相似，但配子体的色素颗粒粗大，多而分散，有沿边分布的现象。 恶性疟配子体呈新月形或腊肠形，常见其边缘上附着一小块皱缩的红细胞膜，有时可见缩成圆形，核位于中央，色素散在核周，其外为一圈胞浆，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和色素，或核和胞浆均消失，只留下色素。,被疟原虫寄生的红细胞：厚血片染色后，红细胞的血红蛋白溶解，其轮廓消失，但斑点却十分清楚。有时尚残留红细胞的模糊痕迹如“影子”，血片边缘部分较薄，更易发现。,模式图 实物照片,细胞核,细胞质,1、早期滋养体（环状体）：,2、晚期滋养体（大滋养体）：,模式图 实物照片,薛氏点,疟色素,3、裂殖体：,未成熟裂殖体,成熟裂殖体,裂殖子,疟色素,4、配子体：,雌配子体,模式图 实物照片,雄配子体,二种疟原虫形态的比较:,环状体,间日疟原虫 恶性疟原虫,雌配子体：,间日疟原虫 恶性疟原虫,雄配子体：,间日疟原虫 恶性疟原虫,子孢子(sporozoite),红外期裂殖体,P.f厚血膜,服药后疟原虫形态,服药后疟原虫形态的变化，是考察药物效果的一种方法。同一类型的药物引起疟原虫的形态变化大致相同。一般说，药物作用使大滋养体、小滋养体和裂殖体前期的形态变化较大，配子体的形态变化较小。最明显的变化有外观破碎，疟色素早期凝聚，裂殖体缩小，有的疟原虫核、细胞浆消失，只余疟色素等。现将几种常用的抗疟药治疗后间日疟原虫在薄血膜上的形态变化分述如下：,奎宁和氯喹 两种药物治疗后疟原虫形态的改变是相似的。 小滋养体 常呈蜘蛛状，核着色深，胞浆着色深淡而模糊，其边缘不规则，有时可见退化的疟原虫呈杆状紧贴于红细胞的边缘。 大滋养体 疏松或有破裂，胞浆稀少，甚至破碎形成空洞，疟色素常凝聚成粗大颗粒或块状，分布于胞浆的边缘或全部被排出虫体之外。有些红细胞内只有核和胞浆而无色素，或只见薛氏点而疟原虫完全退化消失。 裂殖体前期和裂殖体 核疏松或破裂，形状不规则，疟色素常凝聚成粗大颗粒或块状，排出虫体之外。 配子体 核疏松或破裂，胞浆稀少或形成空洞，疟色素常凝聚成块状。,伯氨喹宁 小滋养体 核和胞浆均变稀少，或缩成结实小体，空泡常增大。 大滋养体 核细长疏松或碎裂，有些和中间有些核中间可见空洞，胞浆稀少或破碎，疟色素凝聚成粗大颗粒。 裂殖体 核常裂成碎块，大小不一，胞浆稀少，疟色素凝聚成数块，有时被排除虫体外。未被药物杀灭的大滋养体可继续发育，但在尚未成熟前核及胞浆即开始分裂，裂殖体小而圆，只含数个裂殖子。 配子体 核疏松，胞浆稀少或破碎，疟色素颗粒大，常分布于边缘。,乙胺嘧啶 小滋养体 可继续发育，阿米巴样运动亦不减弱，仅见疟色素凝聚成比较粗大颗粒，分布于胞浆边缘。 大滋养体 核明显胀大，模糊，但不分裂，胞浆稀少，疟色素凝聚成粗大颗粒分布在边缘，亦可见红细胞内几乎充满胀大的核而胞浆全部消失，疟色素也不清楚。给药前如已发育成熟的大滋养体和裂殖体，其核破裂成碎块，大小不一，或与疟色素一起被排出虫体之外；或见核和胞浆均破裂成碎块，疟色素附着核或胞浆上，或游离于红细胞内。 配子体 未见明显的形态变化。,氯喹 氯喹治疗后的恶性疟原虫，小滋养体不能发育为大滋养体。故服药后的第二、三日只能查见小滋养体，且数量少，也不见新一代的小滋养体。,疟原虫与其他物体的鉴别,制作血膜用的玻片必须洁净，玻片表面光滑无斑痕，以免血膜上出现类似疟原虫的物体。但在下列情况下仍可出现类似疟原虫的物体：制作血膜或干燥过程中由空气中掉落之灰尘、霉菌、孢子；自皮肤括取血液时带来的污物及细菌；染色或脱血红蛋白时水中的细菌、原虫及染料沉渣；白细胞破裂之后之颗粒、碎片及网状红细胞之残骸。此外，受染液或水质酸碱度影响，只看到疟原虫小滋养体的核而不见胞浆；或只见到疟色素并无其结构；或只见胞浆断裂的残块。一般说来，在血膜上疟原虫和其他物体两者之一具有一定数量时，不难区别。但是，当两者数量很少又不典型时，鉴别比较困难，应另取血检查。 下列几种情况，容易误认为疟原虫，应注意鉴别；,疑似疟色素 血膜上的染料残渣及灰尘，有时可误认为疟色素，此时可依据其颗粒大小，色泽及分布范围加以区别。转动显微镜的小螺旋时，可见它浮于红细胞之上，与疟色素不在一个平面上。,疑似疟原虫核 细菌尤其是球菌或白细胞破裂后散出的颗粒，皆为红色小点，与疟原虫的核相似，最易混淆。但球菌形体较大，边缘光滑，常见许多个聚集一处，分布较广。中性和酸性折细胞的颗粒，着色较淡，边缘整齐，附近常有白细胞的碎屑。,疑似疟原虫胞浆 网状红细胞残骸和白细胞残骸通常为蓝色，与疟原虫胞浆相似，有时因与上述红点合在一起，而容易误认为疟原虫。鉴别时如形状同大滋养体，可依据疟色素的特点加以区别；如形状同小滋养体，可依据虫体大小、折光是否均匀以及核与胞浆是否在同一平面上加以区别。,水中原虫似疟原虫 水中原虫种类颇多，形态也各异，条件差的实验室，时有用自然水去脱除血红蛋白，或于染色过程中附着于血膜上，其中以自由生活的阿米巴类原虫最易造成误会。因它具有核，原浆及空泡，色泽及形态与间日疟的阿米巴样体颇类似，惟形体较大，不具有疟色素，且空泡多如网状眼，可据此与疟原虫的阿米巴样体区别。,几个疟原虫形态鉴别的难点和重点,四种疟原虫的几个鉴别点,四种疟原虫各期疟色素的特点,四种疟原虫环状体的鉴别,晚期大滋养体与即将成熟雌配子体形态鉴别,七、疟原虫 计数法,在开展疟疾防治、流行病学调查以及有关实验研究中，常需要计算疟原虫的数量求疟原虫密度。现将常用方法介绍如下：,白细胞疟原虫比例计算法 先用常规方法算出每立方毫米血液中白细胞数，然后在油镜下检查薄血膜。观察100或500个白细胞时，将见到的疟原虫数用来推算每立方毫米血液中的疟原虫数。 例如：白细胞总数为6000，在见到500个白细胞视野中查到100个疟原虫，则每立方毫米血液中疟原虫数为6000100500=1200个。,红细胞的疟原虫寄生率计算法 先按常规算出每立方毫米血液中红细胞数，然后油镜检查薄血片，计算1万个红细胞的疟原虫数。用以推算红细胞的疟原虫寄生率。 例如：红细胞数为400万，计算1万个红细胞中有200个疟原虫，则每立方毫米血液中的疟原虫数为400万1万200=8万个。,计算红细胞的疟原虫寄生率时，一般可检查1000个红细胞。但疟原虫密度低下时，则应检查更多的红细胞。 如要求误差在10%以下，可按下列公式求出所需检查的红细胞数：N=45.5（I-P）P。 N为需检查的红细胞数，P为1万个红细胞中的疟原虫数，I为血样单位（以1万个红细胞计算），45.5为常数。 假设P=600，则N=45.5（10000-600）600=713。 此外，计数时应顺血膜中段的横轴检查，不可只检查一个角落，因血片后端和边缘部分疟原虫密度常比前半部或中央部分高。,疟原虫粗略计算法,分级法 按10倍几何级数划分疟原虫密度等级（Trape 1985），以检查厚血膜200个油镜视野为确定阳性或为阴性的界限，以每立方毫米8000个白细胞作为人体白细胞的标准值，然后根据疟原虫密度高低分别计算160个或16个白细胞（每微升白细胞数的1/50或1/500）范围内的疟原虫数，再按下表进行分级和估算每立方毫米的疟原虫数。,*正常厚度血膜上200个视野相当于0.5微升血量，此范围内疟原虫，相当于2个疟原虫/微升。,“加号”法（1）薄血膜“加号”法：在油镜下观察薄血膜100个视野中的疟原虫数，如在20个以下时记“+”2040个时记“+”，4160个时记“+”。（2）厚血膜“加号”法：全血膜发现同种、同期疟原虫数在10个以内记实际数。如P.V.T7，P.F.G3。全血膜发现同种、同期疟原虫数在10个以上，但还达不到平均每个视野1个疟原虫，记“少”。如P.V.T少S.G1，P.F.R少G2。平均每个视野同种、同期疟原虫数在15个时记“+”，610个以上时记“+”11-100个记“+”，100以上时记“+”。,直接计算法 此法适用于了解疟原虫感染的强度，以考核疗效。用血红蛋白吸管吸20微升血液，将其全部吹在玻片上，涂制成4X1厘米大小的均匀厚血膜，按照厚血膜染色法染色。将镜台测微计放显微镜上，测定目镜测微计与镜台测微计和大小比例，然后取下镜台测微计，选择血片的中央部分检查，利用测微计测定好的0.01平方毫米的范围内计数疟原虫，将200个视野内所见的疟原虫总数乘10，即得每立方毫米血液内的疟原虫数。,八、疟原虫常用检 测设备使用方法,显微镜： 主要构成部分由两组透镜即接物镜与接目镜组成。前者将标本放大为倒象，后者将倒象再放大为虚象。因此所见物象是倒的。,显微镜使用法 1、取镜时，必须一手紧握镜臂，另一手平托镜座，靠紧胸前，直到镜座全部放平放稳在台上，才能放手。 2、检查干燥标本，可扭转镜臂使镜身作300400倾斜；检查液体标本，则不宜倾斜，以免沾污镜台或其他部分。此外勿用湿的或污秽的手使用镜子。 3、凡有镜筒的镜子，在一般检查时，应将抽筒抽至160mm处；用油镜时，抽至170