《离子交换层析》PPT课件.ppt

离子交换层析 概述 用于生物大分子物质如酶 蛋白质 多肽 核酸 寡核苷酸 病毒 噬菌体 多糖的分离和纯化 特点 具有开放性支持骨架 具亲水性 多孔性 离子交换层析是以离子交换剂为固定相 以特定的含离子的溶液为流动相 利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异 而将混合物中不同离子进行分离的层析技术 一 离子交换剂 在惰性载体上引入 以共价结合的方式 带有电荷的活性基团 1 按其带电荷的功能基团分类 1 阳离子交换剂 载体上带有负电荷的功能基团 能结合溶液中的正电荷 2 阴离子交换剂 载体上带有正电荷的功能基团 能结合溶液中的负电荷 2 按其载体分类 1 离子交换树脂 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂 聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一网状结构 交联剂 二乙烯苯二乙烯苯交联度 100 苯乙烯 二乙烯苯苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交联度的树脂 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大 获得的树脂交联度就越大 交联度大的树脂结构紧密 孔隙小 大分子量的离子就不能进入树脂颗粒内发生离子交换 交联度的范围从1 16 树脂所含的交换基团性质分为两类 a 阳离子交换树脂 能与溶液中阳离子交换 树脂带负电荷 b 阴离子交换树脂 能与溶液中阴离子交换 树脂带正电荷 根据阳离子和阴离子交换树脂中功能基团的酸碱解离程度分为强 弱两种 a 强酸型阳离子交换树脂 主要以磺酸基 R SO3 为功能基团 它的解离不受外界溶液的影响 典型的交换方程式 RSO3H NaCl RSO3Na HCl b 弱酸型阳离子交换树脂 功能基团为羧基 COOH 酚羟基等 它们解离程度小 交换性能和溶液的pH有关 在酸性溶液中无交换作用 典型交换方程式 RCOOH NaOH RCOONa H2O c 强碱型阴离子交换树脂 功能基团含三甲胺的称为强碱I型 含二甲基乙醇胺称为强碱II型 pH条件都不受限制 典型交换方程式 RN CH3 3 NaOH RN CH3 3OH NaCl d 弱碱型阴离子交换树脂以伯胺基 NH 仲胺基 NH 叔胺基 N 或吡啶基为功能基团 交换能力随溶液的pH条件而变化 pH越低交换能力越强 典型交换方程式 RNH3OH HCl RNH3Cl H2O 离子交换树脂指标 交联度 交换容量a 交联度 交联剂所占的百分比称为交联度 范围从1 16 交联度小 分子结构较疏松 孔径大适用于分离分子量较大的离子性物质 交联度大 孔径小适用分离分子量小的物质 目数 离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20 50目20840 m50297 m100149 m 代表二乙烯苯的百分含量 b 交换容量 指树脂能进行交换的能力 主要决定于树脂网状结构内所含的碱性或酸性基团的数目 以mmol ml或mmol g表之 2 纤维素离子交换剂 在纤维素分子结构上连接一定的离子交换基团就成为离子交换纤维素 3 离子交换凝胶 分离大分子物质如 葡聚糖离子交换剂 琼脂糖离子交换剂 聚丙烯酰胺离子交换剂 二 原理离子交换层析是以离子交换剂 具有离子交换性能的物质 作为固定相 利用它与流动相 洗脱剂 中的离子能进行可逆交换的性质 来分离离子型化合物的一种方法 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应的过程 离子交换过程示意 起始吸附解吸完成x 起始缓冲离子y 待分离离子z 待分离离子 带电荷量少 亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多 亲和力大的后被洗脱下来 三 操作注意点 1 离子交换剂的选择 选择原则 根据被分离物质的性质选择 同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异大的型号的交换剂 考虑因素 1 被分离物质所带的电荷 2 被分离物质分子的大小 3 被分离物质所处的环境 4 被分离物质的物理化学性质 5 被分离物质的大概数量 二 缓冲液的选择 原则 不能发生化学反应 避免使样品发生变性 考虑因素 1 被分离物质的稳定性 蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性 2 在此缓冲溶液的pH条件下 被分离物质所带的电荷性质与交换剂上的平衡离子相等 3 离子交换剂的性质 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换 引起pH变化 降低交换容量 4 缓冲液必须不影响被分离物质的测定 三 洗脱剂的选择 原则 所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团 改变溶液的pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结和力 降低待分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式 梯度洗脱 离子交换层析分离氨基酸及其测定 一 原理氨基酸是两性电解质 各有一定的等电点 pI 在溶液pH小于其pI值时均带正电荷 反之则带负电荷 本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液 分别属于酸性氨基酸 pI2 97 和碱性氨基酸 pI9 74 在pH4 2柠檬酸钠缓冲液中 天冬氨酸 赖氨酸各带有负电荷和正电荷 以强酸型 阳离子交换树脂Dowex50为固定相 由于天冬氨酸在pH4 2柠檬酸钠缓冲液中带负电荷不与树脂结合 首先被洗脱出来 赖氨酸带正电荷 与树脂紧密结合而不被洗脱 随后再通过改变洗脱液的pH值 降低赖氨酸与树脂的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来 氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物 因此可将收集到的水溶液与茚三酮试剂反应 观察其是否生成蓝紫色化合物而判断洗脱情况 并可通过比色定量 二 试剂1 离子交换树脂Dowex50型Dowex50为强酸型阳离子交换树脂 颗粒直径297 m 以带负电荷的磺酸基团 SO3H 为功能基团 它的解离不受外界溶液pH的影响 磺酸基团能够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应 2 洗脱液 1 pH4 2柠檬酸钠缓冲液天冬氨酸pI2 97 pH4 2柠檬酸钠缓冲液带负电荷 赖氨酸pI9 74 pH4 2柠檬酸钠缓冲液带正电荷 2 0 1mol LNaOH改变洗脱体系的pH值 使本与树脂结合的赖氨酸带上负电荷 从而被洗脱下来 3 样品混合液称取天冬氨酸 赖氨酸各10mg溶于10mlpH4 2柠檬酸钠缓冲液中 4 茚三酮显色液氨基酚与茚三酮反应显色以检测氨基酸洗脱情况 三 操作1 层析 将Dowex50装柱后 用0 1mol LNaOH清洗树脂5分钟 再用pH4 2柠檬酸缓冲液平衡10分钟 方法同凝胶层析法 加样8滴 当样品进入树脂后 加入pH4 2柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集 每管收集3ml 控制流速15滴 分钟 当第一