《精氨酸激酶AK》PPT课件.ppt

精氨酸激酶 AK 的表达及其纯化 目录 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作 目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的 目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情 因为要把它与性质 大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难 有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低 这无疑将增加获取足量蛋白质的难度 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 材料的选择 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液 蛋白质初步提纯 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白 直至完全纯化 目标蛋白的鉴定 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 因此 在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下 0 4 操作 注意使用蛋白酶 使蛋白质降解的酶 的抑制剂 避免使用剧烈条件 以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏 一 蛋白质是两性电解质根据蛋白质的分子结构 很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团 作为两性电解质 每种蛋白质都有其等电点 pI 这与它所含的氨基酸种类和数量有关 所有的蛋白质 不管它具有什么样的功能 都能在细胞内起一定的缓冲作用 1 蛋白质的电泳分离凝胶电泳是目前常用的一种生化方法 用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶 该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成 其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物 可进行非变性电泳和变性电泳 1透析2层析原理3凝胶过滤4离子交换层析5亲和层析6电泳 主要内容 1透析 按照分子大小进行分离 分离取决于透析袋截留的分子量 透析液 浓缩的蛋白混合样品 透析袋 开始透析 处于平衡状态 层析也称之色谱 基本原理是分析样品作为流动相流过固相时 由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别 从而达到分离样品中各个成分的目的 层析因固相介质不同又分为离子交换层析 分子筛层析和吸附层析等各种层析 2层析原理 将作为固相成分的不溶性基质 例如葡聚糖凝胶 纤维素 树脂等填充到柱子中 用平衡液平衡 然后加样品 再用适当的溶剂洗脱 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用 最后以不同速率被洗脱出来 达到将各个成分分离的目的 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术 又称之凝胶过滤 分子筛层析或排阻层析 单个凝胶珠本身象 筛子 不同类型凝胶的筛孔的大小不同 1 2凝胶过滤层析 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内 经珠之间缝隙流出 凝胶过滤层析过程示意图 凝胶过滤层析过程示意图 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 蛋白质Mr 49 000 洗出液中的蛋白质浓度 洗脱体积 mL 未知 logMr 洗脱体积与相对分子质量的关系 Andrews的经验公式 logMr K1 K2 Ve Vo 如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响 有时带正电荷 有时带负电荷 此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离 离子交换层析的固相是离子交换体 包括离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换葡聚糖 带有SO3 或COO 基团 通常以SO3 Na 或COO H 形式出现的叫做阳离子交换基 带有N C2H5 基团通常以N C2H5 Cl 出现的叫做阴离子交换基 3离子交换层析 阳离子交换基 强酸性 聚苯乙烯树脂 弱酸性 羧甲基纤维素 弱酸性 螯合作用 聚苯乙烯树脂 阴离子交换基 强碱性 聚苯乙烯树脂 弱碱性 二乙氨乙基纤维素 时刻要记住 蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物 所以蛋白质也存在等电点 pI 蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同 取决于所处溶液的pH值 当pIpH时 蛋白质带净正电荷 举一例子 已知蛋白X等电点为7 设计实验利用阴离子交换树脂纯化 答案 建立阴离子交换柱 比如Q Sepharose 用pH8 5的缓冲液平衡柱子 同时蛋白X溶解于pH8 5的缓冲液中 在此pH值下蛋白X带有负电 将含有蛋白X的混合液上样 然后用起始液冲洗 蛋白X会与此柱结合 然后盐梯度洗脱 阳离子交换层析过程 离子交换树脂 蛋白质 高离子强度洗脱液洗 高离子强度洗脱液洗 加样 平衡液洗 收集 依赖于蛋白质和它的配体 ligand 之间的相互作用来分离的 配体通常指的是能与另一个分子或原子结合 一般是非共价结合 的分子 基团 离子 或原子 但在亲和层析中 配体是通过共价键先与基质结合 配体可以是酶结合的一个反应物或产物 或是一种可以识别靶蛋白的抗体 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时 只有靶蛋白可以特异地与基质结合 而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来 特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下 所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍 4亲和层析 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂珠 或胶粒 亲和层析过程 his tag所用层析凝胶的基质上连接了一个NTA nitrilotriaceticacid 氮基三乙酸 可以与Ni离子结合 而Ni离子与融合蛋白的6Xhis氨基酸之间产生如图的吸引力 从而将带有his tag组氨酸标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来 从图中可以看到 组氨酸残基红色五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键 因此带暴露的His 6的蛋白能结合于固化Ni树脂 用适当缓冲溶液冲洗去其他蛋白后 再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可以回收靶蛋白 电泳 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的 蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上 只要在凝胶的两端加上电场 就可以达到分离蛋白质的目的 这样的电泳称之凝胶电泳 gelelectrophoresis 凝胶可以是淀粉凝胶 starchgel 琼脂糖凝胶 agarosegel 和聚丙烯酰胺凝胶 polyacrylamidegel 一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区 目的是使大多数蛋白质都带有负电荷 这样它们可以向阳极迁移 蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关 电泳技术分类 垂直板电泳 水平板电泳 圆盘电泳 SDS PAGE测定相对分子质量 变性 迁移率与电荷和形状无关 仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 研究背景 精氨酸激酶的简介无脊椎动物的精氨酸激酶 Argininekinase AK ATP N 精氨酸磷酸转移酶E C 2 7 3 3 类似于脊椎动物中的肌酸激酶 creatinekinase CK ATP N 肌酸磷酸转移酶E C 2 7 3 3 是细胞代谢中的磷酸激酶 它将Mg2 ATP上的磷酸基转移到精氨酸上 产生磷酸精氨酸和Mg2 ADP 在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用 AK在体内催化反应方程式如下 主要实验仪器紫外分光光度计U 4300 电脑恒温层析柜 ORIONpH计 紫外检测仪 冷冻离心机 超声破壁仪 雪山制冰机 超纯水机 低温恒温槽电泳仪 电子天平 振荡培养箱 单人单面净化工作台 电热恒温鼓风干燥箱 高压灭菌锅 实验内容 1活化菌种取50 L表达菌种接入6mL的LB液体培养基 含有卡那青霉素 其工作浓度为50 g mL 中 于37 摇床振荡培养8 12小时 2扩大培养将试管中活化的3mL菌液接种到100mLLB培养基 同时加入卡那青霉素 终浓度50 g mL 培养基于37 恒温培养箱中培养2 3小时 3IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间 用OD值表征菌体密度 加入IPTG诱导表达发现 当温度为22 OD 0 6 0 8时 IPTG终浓度为0 5mM时AK的表达量达到最大 4蛋白质提取 1 将上述各管于4 5000r m离心10分钟 2 弃上清 使沉淀物质重悬 每1g沉淀加5mL裂解液 3 在冰上进行10分钟 间隔为2秒钟的超声波破壁 直到沉淀变得澄清为止 4 于4 12000rpm 离心10分钟 取上清 得到AK的粗提液 5His tagNi亲和层析法纯化融合蛋白预处理 1 用2M盐酸胍10mL与树脂打散混合洗涤 2 用StrippingBuffer洗20分钟 蒸馏水洗30分钟 3 1 5M盐酸胍洗30分钟 蒸馏水洗30分钟 4 用1MNaOH洗1小时 用BindingBuffer洗20分钟 蒸馏水洗30分钟 5 用1 5MNaCl洗1小时 用BindingBuffer洗20分钟 蒸馏水洗30分钟 6 Ni柱再生 150mL0 1MNiSO4洗 蒸馏水洗 穿流液无色 BindingBuffer平衡 平衡 6倍柱床体积BindingBuffer pH 8 0 平衡 上样 插A280滤光片 调A值 0 T值 100 打开采集器 打开电脑蛋白核酸检测系统 保存文档并按开始采集 将粗提液45mL上柱 流速约为1 6 1 8mL min 洗脱 上样完后 继续用BindingBuffer pH 8 0 淋洗 待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑 20mM 40mM 80mM 100mM 150mM 洗脱 在280nm处进行连续紫外检测 根据微电脑记录仪显示曲线 分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样 电泳检测纯化程度 6AK的检测SDS PAGE电泳 1 安装双垂直板电泳槽 2 配12 的分离胶5mL 浓缩胶3mL 3 制样 取样品20 L与样品缓冲液10 L混合 100 加热5分钟 4 上样 用微量注射器加样15 20 L 5 电泳 在凝胶上加40V cm电压 待染料进入分离胶后将电压提高到140V cm继续电泳直到染料到达底部 6 固定和染色 用考马斯亮蓝R 250染色液浸泡 加热几分钟 7 脱色 半小时更换一次脱色液 处理3 5次 直到胶板呈现淡蓝色 酶活力及浓度测定采用改进的方法测定精氨酸激酶的活性 这个反应体系含有5 7mM精氨