药用真菌桑黄的研究进展.doc

.药用真菌桑黄的研究进展摘要：桑黄是著名的药用真菌,在抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调节免疫等方面有显著功效。目前世界范围内桑黄类群共包括12个种,其中中国分布7个种。本文综述了桑黄物种多样性、形态特征、地理分布、药用成分、药理作用机制以及人工培养等方面的研究进展。关键词：桑黄；物种多样性；药用真菌。 桑黄是著名的药用真菌,因寄生于桑树而得名,别称桑臣、桑耳、桑黄菇,是隶属于真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、锈革孔菌目Hymenochaetales、锈革孔菌科Hymenochaetaceae、桑黄属Sanghuangporus的一类真菌的统称。 汉代中医经典神农本草经记载“桑耳”,唐代藤权药性论记载桑黄“能治风,破血,益力”,明代本草纲目描述桑黄具“利五脏,宣肠胃气,排毒气”等药用功效。另外,当代中药大辞典对其进行收录,载有桑黄可治疗痢疾、盗汗、脱肛、闭经、泻血、血崩、淋病、崩漏带下、脐腹涩痛等疾病。随着现代科学研究对桑黄抗癌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药用功效、化学成分及作用机制的认识,桑黄已受到越来越多的关注。然而,对于桑黄分类标准不明确、名称使用不规范,导致误用乱用行为已经阻碍了桑黄的研究及应用。本文对桑黄的分类地位、活性成分、药用价值等研究成果进行了概述,旨在更加充分地利用桑黄这一类宝贵的药用真菌资源。1 桑黄属的建立及研究进展 邓叔群首次在中国的真菌书中将桑黄定名为针裂蹄,拉丁学名Phellinus linteus(Berk.&M.A.Curtis)Teng;刘波等在第一版的中国药用真菌将桑黄命名为Phellinus igniarius(Berk.&M.A.Curtis)Teng,中文名称是“火木层孔菌”;应建浙等在中国药用真菌图鉴中称之为裂蹄针层孔菌。进入21世纪后,在传统分类的基础上,分子生物学中的新技术相继引入到桑黄类群的系统发育与分类鉴定中,Wagner等通过分子和形态学研究,将Phellinus属的部分种划入Inonotus sensu stricto类群。随后,Jeong等否定了Wagner对Inonotus s.str.的划分观点,并将该类群划分为Phellinus linteus complex和Inonotus subclade;Lim等对中国、韩国、哥斯达黎加和墨西哥P.baumii和P.linteus标本进行形态学研究,并总结P.baumii和P.linteus种间区分特征;中国真菌志锈革孔菌科中记载,目前国内可以称为桑黄的有两种:P.igniarius和P.baumii。然而,Sell等认为P.ignarius是一个复合种,广泛分布在温带地区的阔叶树树木上,欧洲至少发现12个种。2 桑黄属真菌的主要性状2.1 形态特征担子果多年生,通常具菌盖,有时平伏反转,菌盖蹄形、贝壳形或半圆形,菌盖表面暗棕色、深褐色至灰黑色,新鲜时木栓质,后期硬木质;被绒毛或光滑无毛,成熟时常有径向的开裂;孔口表面黄色、黄褐色至深棕色,菌肉同质或异质;菌丝系统二体系,生殖菌丝简单分隔,无锁状联合;子实层中通常有锥形刚毛存在,部分种类存在结晶。担孢子椭圆形至近球形,淡黄色至深黄色,稍厚壁,光滑,成熟的担孢子在Melzer试剂中无变色反应,在棉蓝试剂中无嗜蓝或者有弱嗜蓝反应。2.2 地理分布迄今为止,世界范围内的桑黄类群有12个种,主要生长在温带、热带及亚热带地区,被子植物的活立木或倒树干上,部分种类的分布具有明显区域性和宿主植物专一性。因此,孔口、担孢子、地理分布及寄主植物常作为该属真菌的分类依据。3 主要的化学成分 桑黄虽然早已被人们熟知,但是,桑黄所对应的拉丁学名与所包括的种类多样性一直存在着争议与变化。近些年,对“桑黄”药理学研究涉及的物种包括:P.linteus、P.baumii、P.ignarius等。这里,需要澄清的是,P.linteus只分布在热带美洲,该种并不分布于东亚地区;P.ignarius尽管与桑黄属真菌比较接近,但其担孢子存在明显差异,桑黄属担孢子为淡黄色至黄褐色,P.ignarius担孢子无色。并且,在系统发育上两者关系较远。由于从事桑黄菌化学成分与药理学研究的学者很难对桑黄的物种进行准确鉴定,因此,这些研究涉及的“桑黄”很可能包括了多个不同的物种,其中有一些种类并不是目前桑黄菌属的种类。现代研究发现“桑黄”含有多种化合物,如:多糖、萜类、酚类、黄酮类等药理功效显著的物质。3.1 多糖类真菌多糖是由多个醛糖和(或)酮糖经糖苷键连接而成的一类高分子聚合物。桑黄多聚糖类是其重要的药用成分,包括-葡萄糖、蛋白多糖和酸性多聚糖等。其中,-(1,3)-葡萄糖因具有免疫调节作用,被广泛用于多种疾病的治疗。桑黄多糖所含的单糖除葡萄糖外,包括半乳糖、甘露糖、果糖、木糖。白日霞等用0.1 mol/L NAOH从P.linteus子实体提取甘露聚糖,Song等采用热水萃取P.linteus菌丝体并纯化,获得糖类和多肽,质量分数分别为8.5%和13.2%,其中,糖醛酸占糖类的6.8%。窦茜茜等通过热水浸提法、离子交换层析等手段,提取高纯度多糖PL-A及蛋白聚糖PL-B。Ge等从P.baumii子实体中分离纯化得到-D-葡萄糖,分子质量为230k D,该多糖含有3种吡喃葡萄糖残基结构,分别是(13)-D-、(14)-D-和(13,6)-D-,其结构主链为3)-D-Glcp-(13)-D-Glcp-(16)-D-Glcp(1。其中,以-(13)-D葡萄糖为主连,C6上分支的多糖有较好的抗肿瘤活性。3.2 黄酮类莫顺燕等利用正相硅胶柱层析、反向HPLC等分离手段从桑黄子实体首次分离得到5种黄酮类和2个香豆类化合物,分别是柚皮素(4,5,7-三羟基二氢黄酮),樱花亭(4,5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮),二氢莰非素(4,5,7-三羟基二氢黄酮醇),7-甲氧基二氢莰非素(4,5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮醇),北美圣草素(3,4,5,7-四羟基二氢黄酮),香豆素(苯并吡喃-2-酮)及莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基苯并吡喃-2-酮)。吴长生对天然野生桑黄和人工培养桑黄95%乙醇提取物进行了化学成分研究,共分离得到57个化合物,从天然桑黄中分离鉴定了50个化合物,其中11个新化合物,包括4个新苄基二氢黄酮。3.3 吡喃酮类及其他成分Park等从P.linteus代谢产物中分离得到hispidin。Hispidin也称为牛奶树碱,其化学结构为6-(1E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基-4-羟基-2H-吡喃-2-酮。随后,研究发现该物质具有清除DPPH自由基和超氧化物阴离子自由基的活性。Lee等从P.linteus提取分离到咖啡酸、4-(3,4-二羟苯基)-3-丁烯-2-酮、(2E,4E)-(+)-4-ionylideneacetic、(2E,4E)-ionylideneacetic、phellilane H、inotilone。Hwang等从P.baumii分离得到5种多酚类化合物,分别是hispidin、hypholomine B、纤孔菌素A(inoscavin)、davallialactone和phelligridin D。Lee等从P.baumii中提取到苯乙烯吡喃酮baumin。现代研究表明,苯乙烯吡喃酮类化合物被认为与植物中的黄酮类化合物具有相似的作用,具有很强的抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等药用特性。此外,桑黄含有的hispolon、原儿茶酸具有良好的雌激素样作用,可能与治疗血崩、闭经等作用相关。4 药理作用4.1 抗肿瘤能力对桑黄多糖抗肿瘤作用研究报道陆续增加,目前,一般认为桑黄多糖通过诱导特异性免疫应答提高宿主免疫功能是其抗肿瘤的主要机制。同时,桑黄含有的蛋白多糖还可以通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)2和4,调节小鼠骨髓树突状细胞(DCs)及主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)等物质的表达,影响DC的抗原呈递功能,进一步增强非特异性免疫应答,从而起到抗肿瘤的效果。另外,Li等通过热水萃取P.linteus菌丝培养基,得到PLPS-1和PLPS-2两种新型多糖,体外抗肿瘤实验结果显示,PLPS-1诱导细胞凋亡有效抑制S-180肉瘤细胞。体内实验也表明,P.linteus多糖活化半胱氨酸蛋白酶-3,介导小鼠体内前列腺癌细胞的凋亡。由此可见,与传统化学药物比较,桑黄多糖作为一种天然产物,毒副作用小并具有强大的抗肿瘤抑制活性,具有潜在的药用价值。除桑黄多糖外,桑黄含有hispidin与其特有衍生物hispolon均具有很强的抗氧化、抗癌、降糖等效果,对多种疾病,如黑色素瘤、白血病、胃癌、乳腺癌、结肠癌等有明显疗效。Zhao研究发现,hispidin能通过抑制ROS/p-ERK/Slug/E-cadherin这一通路,最终表现为细胞间的粘附能力增加,抑制乳腺癌细胞的转移。Hispolon能通过诱导胃癌细胞发生一种特殊的活性氧自由基(ROS)介导的线粒体途径的凋亡,最终,起到抗肿瘤的作用,hispolon还能调控雌激素受体转录和特定蛋白表达途径,抑制MCF7、T47D乳腺癌细胞增值。吴长生等从野生P.linteus提取多酚类化合物,对其进行核转录因子活性检测,发现桑黄多酚类化合物对核转录因子NF-B活性有抑制作用,且具有浓度依赖性。另外,桑黄多酚类成分不但能抑制非竞争性H1N1、H5N1和H3N2神经氨酸酶活性,还可有效抑制病毒诱导牛肾细胞病变(CPE)。此外,桑黄发酵液含有的酶类物质也起到抑制肿瘤的功效。Sun等从Inonotus baumii发酵液分离到由单体蛋白组成的胞外漆酶(IBL),分子质量为66k D,进一步测定纯化漆酶抗癌活性,发现IBL能够抑制肝癌细胞株Hep G2及小鼠淋巴细胞白血病细胞株L1210的增生。这些结果对进一步研究开发桑黄多酚类及酶类抗肿瘤药物提供新的思路。4.2 免疫作用桑黄多糖不但具有增强巨噬细胞、B细胞、天然杀伤细胞等免疫细胞活性的功效,还能增强T细胞非依赖性抗原和三硝基苯基脂多糖抗原性,诱导淋巴细胞发生特异性免疫反应。同时,P.linteus多糖对细胞色素P450家族(CYP 1A1,CYP 1A2,CYP 2B1,CYP 2E1)也具有显著的抑制作用。另外,Kim等研究发现桑黄酸性多糖(acidic polysaccharide)通过活化腹膜巨噬细胞诱导细胞免疫抑制黑色素瘤细胞B16增长,同时上调一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-(TNF-)介导淋巴细胞(Yac-1 cells)毒性反应,启动特异性免疫应答。4.3 降糖能力胰岛素是由胰岛细胞分泌的一种蛋白激素,平衡机体糖分和脂质的代谢。胰岛细胞受损会降低胰岛素的分泌,进而引发糖尿病。现代研究发现真菌中的多糖具有良好的降糖效果,主要通过影响糖代谢,调节胰岛细胞和增强胰岛素敏感性等方面降低血糖水平并缓解糖尿病症状。桑黄多糖可抑制-葡萄糖苷酶活性,延缓碳水化合物分解速度,降低糖毒性,延缓糖尿病的发展。Wang等发现从Phellinus baumii提取物,作用于链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型小鼠,发现给药量达到400 mg/kg时,血液中胰岛细胞增加,糖化白蛋白水平降低,使胰岛素水平升高,从而证明P.baumii提取物具有明显的降糖效果,这一结果说明P.baumii降糖机制可能与其刺激胰岛素释放或减少胰岛素降解有关。Cho等探讨了桑黄菌丝胞外多糖(Pb EPS)的降糖机制,经过口服给药200 mg/kg,治疗周期52 d后,与对照组相比,治疗组小鼠体内血糖浓度降低32%,同时,小鼠体内游离的甘油三酯浓度也明显下降,进一步分析其作用机制,发现EPS能上调小鼠脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-)的mRNA表达水平,通过活化PPAR-发挥转录调控作用,从而影响脂质代谢途径,增强胰岛素敏感性。4.4 抗氧化Phellinus linteus热水提取液表现出较高的抗氧化活性,对DPPH具有一定清除能力,可用于风湿性关节炎等自身免疫疾病的治疗。另外,P.linteus内高分子量PL-N多糖,通过测定体外抗氧化活性,结果表明经降解的低分子量多糖拥有更活跃的羟基自由基清除能力。除此之外,桑黄多糖还能够螯合亚铁离子,达到降低铁离子浓度的效果。此外,桑黄含有的酚类、黄酮类化合物也是主要的抗氧化活性物质。4.5 消炎抗菌桑黄中(13,6)-D-多糖类物质可有效抑制RAW 264.7细胞分泌TNF-,抑制炎症的发生,进一步研究发现,该类多糖还可刺激RAW264.7细胞分泌白介素10(IL-10),同时,下调白介素6(IL-6)的表达。因此认为,桑黄多糖可以起到调节IL-6与IL-10动态平衡的作用,二者在全身炎症反应综合征患者中有预警作用。除此之外,P.linteus含有hispidin是一种非竞争抑制剂,对脯氨酰寡肽酶(prolyl endopeptidase)具有抑制作用,对-分泌酶,丝氨酸蛋白酶如:胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶抑制作用不明显。这些研究表明,桑黄在慢性炎症性疾病、肥胖、2型糖尿病、躁狂和抑郁症和老年痴呆治疗可能具有缓解作用。Phellinus baumii乙酸乙酯提取物(PBEAE)可以降低CD3(T细胞),CD19(B细胞),CD4(辅助T细胞),CD8(细胞毒性T细胞),MHC II类/CD11c(抗原递呈细胞),双阳性B220/CD23和CD3/CD69等相关免疫细胞的表达。另外,P.baumii还能抑制中性粒细胞Gr1CD11b在关节炎处的浸润,避免对软骨关节的侵蚀;同时,下调免疫球蛋白G,TNF-,IL-1和IL-6在血清中的浓度,从而缓解炎症的影响。综上所述,桑黄被认为在治疗风湿性关节炎方面具有积极功效。近期有研究发现,PBEA一方面抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)合成青霉素结合蛋白(PBP2a),且呈剂量依赖性,另一方面协同-内酰胺抗生素(新型青霉素和头孢唑啉)增强抗菌作用,从而治疗MRSA感染的患者。5 人工培养 桑黄作为药用真菌具有较高的药用价值,并且具有悠久的使用历史,但由于天然子实体少,大量采集还会对资源造成破坏,因此逐渐开展了一些关于桑黄菌丝体培养和人工栽培技术方面的研究,采用固体培养、液体发酵、子实体人工栽培等方法获得药用活性物质。5.1 固体培养桑黄固体培养研究以菌丝生长量为指标,筛选最佳培养基组成成分、浓度配比、最适培养条件等。雷萍等采用组织分离法获得桑黄纯菌株,并进行了固体培养条件研究,结果表明:最适温度为28;最适p H为6.5,最适碳源是葡萄糖,最适氮源是蛋白胨。骆婷对桑黄最佳固体培养基成分和培养条件进行了筛选,获得碳源、氮源及其浓度的组合为:葡萄糖3%,蛋白胨4%;微量元素及其浓度组合为:磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.1%,硫酸铜0.2%,复合维生素B 0.05%,维生素E 0.05%;最适培养温度为25。蒋宁等以桑黄菌丝体生物量、粗多糖和黄酮产量为指标,筛选最适固体培养基组合为:玉米粉70%,豆粕28%,蔗糖2%,KH2PO40.1%,K2HPO40.1%,维生素B10.01%,料液比11.85.2 液体发酵桑黄液体发酵的培养条件因种而异,采用单因素试验和正交试验、响应面分析方法,对发酵液的营养条件和环境等因素进行优化,提高桑黄菌液生产菌丝体、胞内多糖及胞外多糖等活性物质产量。方白玉等研究显示桑黄菌丝体培养基组合:甘蔗渣17%,马铃薯9%,KH2PO40.3%,Mg SO40.15%。田雪梅对桑黄液体发酵培养及优化,筛选出8个相关因子分别为:玉米粉,葡萄糖,蛋白胨,酵母抽提物,麸皮,KH2PO4,Mg SO47H2O和发酵液起始PH。进一步采用4因素3水平的Box-Behnken设计法获得发酵培养基最佳条件:玉米粉38.96 g/L,葡萄糖25.00 g/L,蛋白胨3.75 g/L,酵母抽提物4.15 g/L,麸皮20.55 g/L,KH2PO41.25 g/L,Mg SO47H2O 0.625 g/L和PH 6.39。振荡培养6 d后,菌丝生物量达18.330.86 g/L,达优化前2.5倍。李朔以胞内多糖产量为指标,获得Phellinus.baumii最优液体培养组合为:黄豆粉,可溶性淀粉,PH 5.0和C/N为11。另外,P.vaninii产胞外多糖(EPS)的最佳培养基组合为:蔗糖40 g/L,玉米粉4 g/L,KH2PO44 mmol/L和PH 7。接种后恒温28,摇床转速160 r/min,发酵8 d后,EPS产量达0.352 g/L。5.3 人工栽培人工代料栽培是高效获得桑黄子实体的主要途径。在国外,日本和韩国桑黄的人工栽培研究较早,并取得巨大经济效益。韩国学者采用短原木大棚栽培桑黄和室外荫棚木段埋畦栽培桑黄的方法均取得成功。国内对桑黄子实体栽培研究以有效成分的含量为导向,结合桑黄子实体产量,主要集中在改进菌种栽培方法,控制人工栽培条件和提高管理措施等方面。杜萍等发现,空气相对湿度对桑黄菇的生长速度及质量有很大影响。桑黄耳芽生长最适的空气相对湿度为85%95%,生长20 d后,相对空气湿度调整为95%更有利于桑黄子实体的生长。Zhang等分别以桑树枝、混合木屑和上述两者等量混合物为基质培养Phellinus baumii,进一步测定子实体多糖的抗氧化活性,实验结果表明,以等量桑树枝和木屑的混合物为基质培养P.baumii,可提高P.baumii子实体多糖的抗氧化性能。 俞忠明等研究结果显示,不同生长期桑黄中的总多糖、呋喃酮Inoscavin A含量有一定差异,两者在采集时间内变化趋势基本一致,均以出菇22 d采集的样本含量最高。而多酚H