《级研究生实验》PPT课件.ppt

PartIT细胞表型测定 一 PartII小鼠脾细胞分离技术 实验一 潍坊医学院免疫学教研室林志娟Tel 8462530Email myx PartIT细胞表型测定 一 免疫细胞的分离 细胞涂片 固定及保存 原理 T细胞是一个复杂的 不均一的整体 根据其发育的不同阶段 表面标记以及功能 可将其分为不同的亚群 T细胞介导细胞免疫应答 并且对B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用 T细胞表面标志的检测 有助于了解机体的细胞免疫功能 对免疫缺陷病 肿瘤 自身免疫性疾病 病毒感染 移植排斥反应等疾病的诊断 分型 预后和疗效观察有着重要的意义 共有标志 CD3 总T细胞特有标志 CD4 T细胞 辅助细胞 CD8 T细胞 杀伤细胞 T淋巴细胞表面标志 外周血正常值 CD3 60 80 CD4 35 55 CD8 20 30 CD4 CD8 约1 4 2 0CD4 CD8 1 4 免疫缺陷病 如艾滋病 0 5 恶性肿瘤 再生障碍性贫血 某些病毒感染 CD4 CD8 2 0 自身免疫性疾病 如SLE 类风湿关节炎等 SABC AP法测定T细胞亚群 SABC 链酶亲和素 生物素链酶亲和素 一种糖蛋白 可由蛋清中提取 分子量60kD 每个分子由4个亚基组成 可以和4个生物素分子结合 亲和素与生物素一经结合就极为稳定 形成一种类似晶格的复合体 AP 碱性磷酸酶 酶标生物素 亲合素A B 实验基本流程 间接SABC AP法 T细胞亚群检测 淋巴细胞 小鼠抗人CD3 CD4 CD8分子单克隆抗体 一抗 二抗 生物素化 标有AP的SABC 酶底物显色剂 BCIP NBT 酶将底物催化显色 阳性细胞膜上显色 此为间接法 直接法 不用二抗 将SABC物直接标记于一抗 一抗价格昂贵 实验材料 肝素 淋巴细胞分层液 Hank s液 PBS等 一次性注射器 试管 滴管 离心机 微量移液器 玻片 显微镜 温箱等 鼠抗人CD3 CD4 CD8单克隆抗体 一抗 羊抗鼠IgG 生物素化二抗 SABC AP 底物 BCIP NBT磷酸甲苯胺蓝盐 等 实验步骤 标本的制备 淋巴细胞悬液的制备标本的染色 结果的观察 1 标本制备 淋巴细胞悬液的制备 1 取肝素抗凝血5ml与5mlHank s液稀释混匀 每组取2ml 用滴管贴管壁轻轻叠加于2ml淋巴细胞分层液上 配平后1500rpm离心10mins 2 洗涤细胞 用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的淋巴细胞 滴管吸之前先排除空气 防止分层 滴管转动一圈确保都吸完 放入盛有2mlPBS液的试管 吹打目的洗细胞表面杂质 暴露表面分子 1500rpm离心10mins 弃上清 直接倒一次 将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入PBS液洗涤 1500rpm离心5mins 加入2ml重复洗涤一次 3 弃上清 淋巴细胞沉淀用200 l以上PBS溶解 取20 l细胞涂片 下一次实验检测T细胞亚群用 2 标本染色 细胞涂片用记号笔划圈 滴固定液1滴 室温固定2 3min 已做 滴加鼠抗人CD3 CD4 CD8抗体15 L 轻轻摇晃 使单抗均匀铺在细胞表面 37 孵育2 3h 使Ag Ab结合 PBS洗3次 洗掉没结合的一抗 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体15 L 37 孵育30 45min PBS洗3次 滴加SABC15 L 37 孵育30 45min PBS洗3次 洗掉没结和的二抗 滴加显色剂30 50 L 室温显色20 40min 可在显微镜下观察 待细胞膜上出现红色标记物时 用PBS淋洗 滴加细胞核复染液1滴 30秒后自来水淋洗 显微镜下观察结果 注意事项 以上操作中 37 孵育时应将玻片置于湿盒中 切勿干片 特别是加底物后 干片将导致阴阳性结果不能分辨 观察结果时应使涂片保持湿润 结果观察 高倍镜下计数100 200个单个核细胞 计算阳性率 阳性细胞 细胞表面呈红色 标准阳性 细胞表面呈红色 可见深蓝色细胞核 强阳性 细胞周缘及中央均呈红色 看不见细胞核 弱阳性 细胞表面呈淡红色 可见淡兰色细胞核 阴性细胞 细胞表面无着色反应 呈淡兰色 注意事项 为防止污染试剂 加样器吸头最好为一次性使用 分离单个核细胞中 将稀释血液加于分层液上时 务必要使之形成良好的界面 否则影响分离结果 孵育过程中 应将涂片置于湿盒中 操作中始终要注意保持涂片的湿润 以确保得到完美的实验结果 淋洗时不要直接对着细胞冲 避免细胞脱落 淋洗后 加试剂前须擦干细胞圈外水分 以免试剂流散 PartII小鼠脾细胞分离与制备技术 实验器材 实验动物 小鼠 细胞培养液 试管 滴管 离心机 培养皿 100目细胞筛等 小鼠拉脱颈椎处死 用碘酒 酒精消毒皮毛 剪开皮肤 打开腹腔 小鼠趴着 脾位于左侧 找到红色的脾脏 用镊子分离后摘除 将脾脏放入盛有5 10ml培养液的平皿中轻轻漂洗 并细心剥除周围的结缔组织 将脾脏移入另一个盛有5 10ml培养液的平皿中 轻轻漂洗后置于100目细胞筛中 轻轻挤压使脾细