《线粒体钙超》PPT课件.ppt

1 CalciumHomeostasisandCalciumOverloadinCell 细胞内钙稳态与钙超载 Pathophysio Dep OfSDU袁中瑞 2 Inalleukaryoticcells thecytosolicconcentrationofCa2 ions Ca2 C istightlycontrolledbyinteractionsamongtransporters pumps channelsandbindingproteins Finelytunedchangesin Ca2 Cmodulateavarietyofintracellularfunctionsrangingfrommuscularcontractiontosecretion anddisruptionofCa2 handlingleadstocelldeath 3 细胞内钙稳态调节 CalciumHomeostasisinCell细胞内钙超载 calciumoverloadincell 线粒体与钙 mitochondriaandcalcium 4 一 CalciumHomeostasisinCell 5 Fig 1 Ca2 distributioninthecell HighandlowCa2 domainsaremarkedwithorangeandblue respectively From Calciumsignalingandapoptosis BiochemBiophysResCommun 2003May9 304 3 445 54 6 7 一 钙平衡1 钙瞬变值 Ca2 EC 1 10mM Ca2 C 0 1 10 M细胞内钙 44 存于胞内钙库 肌浆网 内质网 细胞内游离钙仅0 005 生理性钙瞬变值 即细胞内钙浓度的增加 平均介于0 1 10 M之间 钙荧光探针 indo 1 fura 2 fluo 3AM等等 以及Aequorin 水母发光蛋白 GFP basedfluorescentCa2 probes suchascameleonsandpericams 等 8 9 10 2 钙移动的决定因素 钙的平衡和钙的瞬变值依赖于两组蛋白质一组负责钙的输入和激活钙释放另一组负责钙的输出和摄取回收 1 Ca2 进入胞液的途径 2 Ca2 离开胞液的途径 11 1 Ca2 进入胞液的途径 Ca2 进入胞液是顺浓度梯度的被动过程细胞外Ca2 跨膜入胞 细胞内Ca2 释放细胞内Ca2 增加主要取决于内Ca2 释放另外Ca2 还可通过Na Ca2 交换蛋白进入胞液 12 1 细胞膜Ca2 通道 电压依赖性Ca2 通道 voltage dependentcalciumchannel VDC 其活动受膜电压变化的影响L 型 Lasting 持续型 特点是开启后产生持续Ca2 内流 可被钙通道阻滞剂所阻断 T 型 Transitory 短暂型 开放时间短暂 很快失活 N 型 Neuronal 神经型 开放时间介于L T型 只存在于某些神经元上 13 受体操纵性钙通道 receptor operatedcalciumchannel ROC a配体与受体结合后 直接调节钙通道开放 b配体与受体结合后 G蛋白偶联 调节钙通道开放 c受体与配体结合后 G蛋白偶联 产生第二信使 修饰VDC 可能是L 型VDC 调节VDC对Ca2 的通透性 14 eg 1受体激动剂 G蛋白 AC cAMP PKA 磷酸化钙通道 胞外Ca2 内流 15 2 细胞内贮存钙释放的机制 细胞内游离Ca2 主要贮存于内质网 ER 肌浆网 SR 中 经Ca2 释放通道释放 1 4 5 三磷酸肌醇 IP3 敏感钙池 受IP3受体系统调控IP3不敏感钙池 受ryanodine受体系统调控 16 IP3受体系统 当IP3与IP3受体 IP3R 结合 开放钙通道 ER SR中的钙释放入胞浆中IP3R type 介导的Ca2 释放依赖于一定浓度的胞浆Ca2 Ca2 i 呈钟形反应 bell shapedresponse IP3R type 则更接近线性反应 IP3R系统释放细胞内钙受许多因素影响 Ca2 i 碱性环境中Ca2 释放增加K 通过K 通道进入钙池 进而促进Ca2 释放肝素是IP3R的持异性拮抗剂 17 ryanodine受体系统 在多种细胞内普遍存在ryanodine受体 以下简称RyR 调节IP3不敏感钙池内钙的释放 现知RyR至少有3种亚型 RyR1存在于骨路肌SR上 有5032 5037个氨基酸残基 RyR2存在于心肌上 有4967个氨基酸残基 RyR3存在于非肌性细胞上 比前两者小得多 只有641个氨基酸残基 18 Ca2 与RyR上的Ca2 结合位点结合 而触发SR ER释放Ca2 这种Ca2 诱发Ca2 释放 calciuminducedcalciumrelease CICR 的正反馈机制是RyR系统触发Ca2 释放的特征 普鲁卡因 钌红为RyR的拮抗剂 咖啡因 ryanodine为其激动剂 19 3 Na Ca2 交换蛋白 Na Ca2 交换蛋白 为双向性离子转运器 催化Na 从膜的一侧转运到另一侧 以交换Ca2 的相反方向的运动 3Na Ca2 是产电的 20 Na Ca2 交换是利用业已建立起来的离子的电化学位能 即由Na K ATPase建立的胞内外 Na 梯度 而不直接利用ATP Ca2 流动的方向取决于 Na 梯度的方向 只是后者的方向相反 Na Ca2 交换的可逆电位约在 15mV到 30mV之间 膜电位负于可逆电位时 Na 内向和Ca2 外向运动 反之 膜电位正于可逆电位 也即膜去极化 则Na 外向而Ca2 内向运动 21 2 Ca2 离开胞液的途径 Ca2 离开胞液是逆浓度梯度 耗能的主动过程 1 Ca2 ATP酶2 Na Ca2 交换蛋白 22 1 Ca2 ATP酶 心肌细胞主要依靠Ca2 ATP酶转运Ca2 回到细胞内贮存系统或移出细胞外 恢复细胞内的Ca2 稳态 Ca2 ATP酶有10个螺旋疏水节段 称为M1 M10 在M4 M5 M6 M8形成的一个通道中有2个对Ca2 具有很高亲和力的结合位点 这10个螺旋疏水节段与3个细胞质亲水环相连接 亲水环包含ATP结合位点和磷酸化位点 23 细胞膜Ca2 ATP酶 利用ATP提供的能量逆细胞膜两侧高的电化学梯度泵出Ca2 其活性受钙调蛋白 PKA PKC等因子的调控 细胞器 内质网及肌浆网 钙ATP酶 位于细胞内钙贮存系统 细胞器 膜上 蓄积Ca2 到细胞器腔中 心脏和血管的肌浆网Ca2 ATP酶构型具有特殊性 其功能调节依赖于一种辅助性跨膜蛋白 受磷蛋白 24 受磷蛋白 phospholamban PLN 受磷蛋白由五个亚基 分子量6KD 组成 每个亚基均可磷酸化 有两个不同的磷酸化位点 分别对cAMP依赖的蛋白激酶A PKA 和另一种钙调蛋白依赖的蛋白激酶起反应 受磷蛋白的磷酸化 肌浆网Ca2 ATP的跨膜结构改变 Ca2 ATP的泵能力随后被激活 HF NE R PKA Pi化PLN 非Pi化PLN 心肌舒张功能障碍 25 2 Na Ca2 交换蛋白 在细胞内高钙时作为钙输出系统工作Na Ca2 交换其转运Ca2 的速率高 约为钙泵的几十倍 Ca2 3Na 胞外 胞内 26 27 举例 给予 激动剂 心肌收缩力 舒张速率 L VDC PLN Ca2 ATPase Ca2 ATPase 28 二 细胞内钙超载 29 Temporallyandspatiallyorganizedincreasesin Ca2 c Ca2 m and Ca2 nrepresentoneofthemostcommonlyusedintracellularsignals However prolongedchangesinCa2 distributionincludinganelevationin Ca2 c Ca2 m and Ca2 nanda Ca2 decreaseinERtriggeravarietyofcascadesthatleadtocelldeath 30 1972年Shen和Jennings发现犬心脏冠状动脉短暂闭塞后复灌可加速细胞内Ca2 的积聚 并首次提出钙超载之说 此后 Ca2 在再灌注损伤中的作用一直成为人们研究的重点 各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为钙超载 calciumoverload 31 PossibleCorrelationofCalciumOverloadwithCytotoxicity Increasingof Ca2 C calciumoverload istheprimarycauseofcytotoxiceffects includingnecrosisandapoptosis oftoxicantsandstressinducedresponses eg Cardiotoxicity oxidativestress ischemia reperfusion Hepatotoxicity CCl4Immunotoxicity glucocorticoidsKidneytoxicity oxidativestress heavymetalsNeurotoxicity lead ischemia excitatoryaminoacid 32 RoleofCalciumOverloadinCellularInjury Relationof Ca2 Ctoearlyreversibleinjury blebandcytoskeletalalteration cellvolumechanges nuclearchanges condensationofmitochondriaRelationof Ca2 Ctoirreversibleinjury swollenmitochondria DNAstrandbreak 33 一 Ca2 超载的的形态学资料 电镜 大多内流的Ca2 都局限于mito基质内的致密体内 细胞Ca2 超载的显示器 mito内Ca2 的大量内流是再灌注收缩早期的特征现象 形态学变化 缺血40min时 肌纤维水肿 mito肿胀 无Ca2 流入mito的迹象 再灌注时 心肌细胞超微结构的损伤 收缩带的形成 心肌纤维的断裂和肌纤维膜的破坏 细胞急剧肿胀 并出现mito内致密体 用Ca2 荧光探针表明 心肌缺血90秒 已发生细胞内Ca2 短暂缺血后再灌注早期 细胞内Ca2 暂时 缺血30分钟后复灌 渐进的稳定的Ca2 34 二 Ca2 超载的机制 1 Na Ca2 交换异常2 内源性儿茶酚胺释放增多3 生物膜损伤 35 1 Na Ca2 交换异常 在心肌缺血和再灌注时 Na Ca2 交换蛋白以反向转运增强 成为Ca2 进入细胞的主要途径 胞外 胞内 Ca2 3Na 36 1 细胞内高Na 对Na Ca2 交换蛋白的直接激活 缺血 缺氧 ATP Na ATPase失灵 细胞内Na 浓度升高再灌注 氧 ATP 激活Na Ca2 交换蛋白细胞内高钠 Na Ca2 交换蛋白以反向转运的方式加速Na 向细胞外转运 同时将大量Ca2 运入胞浆 37 2 细胞内高H 对Na Ca2 交换蛋白的间接激活Na H 交换蛋白 细胞膜Na H 交换蛋白是离子逆向转运蛋白Na H 交换蛋白主要感受细胞内H 浓度的变化 利用H 电 化学梯度作为动力来源 以1 1的比例将细胞内H 排出细胞 而将Na 摄入细胞 这是维持细胞内pH稳定的重要机制 Na H 胞外 胞内 38 缺血 无氧代谢 细胞内 外 H 浓度 再灌注 胞外 H 胞内 H 仍高 跨膜H 浓度梯度形成 激活Na H 交换蛋白 促进细胞内H 排出 而细胞外Na 内流 如果内流的不能被Na ATPase充分排出 细胞内高钠就可继发性激活Na Ca2 交换蛋白 促进Ca2 内流 加重细胞内Ca2 超载 动物实验中应用Na H 交换抑制剂可减轻心肌缺血再灌注损伤 但在近年临床患者的实验中 Na H 交换抑制剂并未对高危患者显示出明显的保护作用 提示还有其他机制介导再灌注性心肌损伤 39 2 内源性儿茶酚胺释放增多 生理条件下 心功能主要受 肾上素能受体调节 1肾上素能受体的调节作用很小 但缺血 再灌注损伤时 内源性儿茶酚胺释放增多 1肾上素能受体的调节也相对起重要作用 40 1 1肾上素能受体 1肾上素能受体激活G蛋白 磷脂酶C PLC 介导的细胞信号转导通路 促进磷脂酰酯醇 PI 分解 生成三磷酸肌醇 IP3 和甘油二酯 DG IP3与肌浆网上的IP3受体结合促进钙池内钙释放 DG进一步激活PKC 而PKC可促进Na H 交换 进而增加Na Ca2 交换 使胞浆Ca2 浓度升高 41 2 肾上素能受体兴奋 肾上素能受体兴奋可通过增加L型Ca2 通道的开放促进Ca2 内流 1受体激动剂 心肌细胞后 通过G蛋白偶联激活AC cAMP 激活PKA 磷酸化L型钙通道 使其对Ca2 通透性增高 胞外Ca2 内流 42 在缺血前或再灌注前应用Ca2 通道阻滞剂阻断Ca2 内流 可见细胞坏死程度减轻 提示Ca2 通道是细胞外Ca2 进入胞浆造成Ca2 超载的途径之一 但在再灌注后应用Ca2 通道阻滞剂往往不能有效的防止细胞内Ca2 浓度升高 43 3 生物膜损伤 细胞膜和细胞内膜性结构是维持细胞内 外以及细胞内各间区离子平衡的重要结构 生物膜损伤可使其通透性增加 细胞外Ca2 顺浓度差进入细胞 或使细胞内Ca2 分布异常 加重细胞功能紊乱与结构破坏 44 Cellularmembrane Cellularmembrane PLA2 lipidbreakup Ca2 normal 无Ca2 再灌注 glycocalyx glycocalyx 1 Ca2 反常 45 2 自由基损伤膜 膜结构破坏 3 肌浆网膜损伤 Ca2 ATP酶功能抑制 使肌浆网摄Ca2 减少 4 线粒体膜损伤 抑制氧化磷酸化 使ATP生成减少 细胞膜和肌浆网膜Ca2 ATP酶能量供应不足 促进Ca2 超载的发生 细胞膜Na ATP酶能量供应不足 细胞内Na 含量明显增高 激活Na Ca2 交换蛋白 Ca2 内流增多 46 三 钙超载引起再灌注损伤的机制 1 激活多种酶 Ca2 i 磷脂酶 细胞膜及细胞器膜的损伤花生四烯酸 arachidonicacid AA 环氧合酶 PGI2 PGD2 PGE2 TXA2脂氧合酶 白三烯 LT LTB4 LTC4LT 趋化性 WBC 激活M 细胞色素P 450加单氧酶 抑制钠泵的代谢产物 Ca2 i 蛋白酶 细胞膜和结构蛋白的分解 AA 47 Ca2 i ATPase ATP的消耗 Ca2 i 核酶 ribozyme 染色体的损伤2 促进氧自由基生成 次黄嘌呤 Ca2 i XO 黄嘌呤自由基 尿酸3 再灌注性心律失常 Ca2 i Na Ca2 交换 一过性内向电流 在AP后形成延迟后除极 心律失常 48 4 肌原纤维过度收缩 收缩带 Ca2 i 肌原纤维过度收缩 收缩带 肌纤维断裂Mechanism 缺血期堆积的H 迅速移走 抑制作用 再灌注 重新获得ATP Ca2 i肌原纤维过度收缩 甚至是不可逆性缩短损伤细胞骨架结构 心肌纤维断裂 49 实验证据 单个心肌细胞内注射Ca2 细胞的过度收缩结扎猪冠状动脉前降支45min 恢复血流 经冠脉给与直接抑制肌原纤维收缩的药物BDM 再灌注后心肌梗死的面积比对照组减少50 5 线粒体功能障碍ATP生成不足 启动细胞的死亡是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤 50 三 线粒体与钙 线粒体被认为是细胞内最大的钙池之一 生理状态下 可以有效地缓冲细胞内Ca2 浓度变化 心肌缺血后 其损伤的发生 发展与线粒体内Ca2 稳态失调关系密切 目前研究证实 在多数条件下 线粒体内Ca2 的过度聚集使膜通透性转运孔 mitochondrialpermeabilitytransitionpore MPTP 开放 引起线粒体功能障碍和与启动细胞死亡事件相关蛋白的释放 启动细胞死亡 51 线粒体的结构 由内外两层膜封闭 包括外膜 内膜 膜间隙和基质四个功能区隔 在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为 基质67 内膜21 外膜8 膜间隙4 线粒体结构模型 52 一 线粒体内Ca2 的转运 1 线粒体内Ca2 与钙微区钙微区 calciummicrodomain 是指当单个钙释放通道或小群通道开放时 形成通道口附近的局部Ca2 浓度升高 少量激活内质网上的IP3型钙释放通道 胞浆内钙微区 周围的线粒体可感受到钙微区 线粒体内Ca2 浓度快速上升 mito 内质网 80nm线粒体内Ca2 聚积影响内质网对Ca2 的摄取与释放 两者之间可进行Ca2 循环 而且 线粒体对内质网Ca2 释放有调节作用 53 2 线粒体内钙离子的转运方式及调节 产电的顺向转运Uniporter 两种交换 3Na Ca2 逆向转运 2H Ca2 逆向转运 54 1 themitochondrialCa2 uniporter MCU isontheinnermembrane thePathwayofmitotakingupCa2 Actlikeachannel openingwithincreasedprobabilityoncethelocal Ca2 crises Low affinity itsactivitywouldbeextremelylowatrest TakingupCa2 attheexpensesof m 150 200mV 可被钌红 ruthiniumred 和La3 特异性抑制 55 MCUstartstobeactivatedat2 5 Moflocal Ca2 c Attheaverage Ca2 cisnear10 Mduringactivation buthigherCa2 concentrations 10 100 M canbereachedatlocalcellsspots athighCa2 microdomains TheactivityoftheMCUisverysmallorabsentatcytosolic Ca2 below0 5 M whereasitsactivityincreasesdramaticallyalongthemicromolarrange reachingsaturationabove100 M Global Ca2 cincreasingabletoactivateMCUcanalsobereachedduringCa2 overloadunderpathologicalcircumstancesanddousuallydrivetomitochondria triggeredcelldeath MCU 56 2 Pathwayofcalciumeffluxingfrommitochondria Mito3Na Ca2 exchanger ispredominantinheartandbrainmitochondriaandiselectrogenic Ca2 2H exchanger isnonelectrogenicandispresentinliverandkidneymitochondria MPTParegulatedpore whichhastwodifferentopenstatesandcanopentransiently DuringphysiologicalCa2 signals anincreasein Ca2 misfollowedbyatransientreleaseof Ca2 m 57 ActivationofMCUoccurswhenthe Ca2 cintheneighbourhoodofthemitochondrialmembraneincreasestothemicromolarrange Undertheseconditions therateofCa2 entrythroughtheuniporterexceedsthatofCa2 extrusionthroughtheexchanger leadingtoafastincreasein Ca2 m Summarize 58 是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤 二 线粒体钙超载与细胞损伤 59 60 1 线粒体钙超载使ATP合成障碍 生理状态下 Ca2 m 调节mito产能细胞受到生理剌激时 Ca2 由钙库释放 线粒体产生短暂而局部的Ca2 上升 线粒体脱氢酶活性增加 细胞缺血 Ca2 m增加 线粒体脱氢酶活性增加 产生更多的ATP以满足细胞需要 Ca2 m过度持续增加 可引起线粒体膜通透性转运孔 MPTP 不可逆过度开放 小于1500道尔顿的分子或离子可以通过线粒体内膜 H 由此进入线粒体基质 引起ATP合成障碍 61 化学渗透学说 认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H 的跨膜梯度 这一学说得到公认并获得了1978年诺贝尔奖 呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H 逆浓度梯度泵出线粒体内膜 H 不能自由透过线粒体内膜 在线粒体内膜两侧形成质子跨膜梯度 pH及跨膜电位 线粒体外的H 可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H 浓度梯度进入线粒体基质中 H 顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATP的合成 62 2 线粒体钙超载导致MPTP不可逆过度开放 MPTP是由电位依赖性离子通道 是孔蛋白 腺苷酸移位酶及亲环素D复合物在内外膜交接处构成的一种复合结构 MPTP在生理状态下呈间断性开放 且具有可逆性 能造成 m的降低 线粒体内Ca2 减少和内部产生自由基减少 使细胞维持正常的生理功能 若MPTP不可逆过度开放可导致 m崩溃 呼吸链解偶联 ATP合成停止 线粒体基质外流 还原性谷胱甘肽耗竭 超氧阴离子大量产生 最终导致基质渗透压增高 线粒体内腔肿胀 63 线粒体钙超载产生缺血再灌注损伤的重要机制之一就是线粒体基质Ca2 浓度持续升高致使线粒体内膜MPTP不可逆过度开放 64 1 MPTP开放引起细胞色素C释放 细胞死亡 在细胞色素C含量丰富的细胞 通过快速凋亡机制包括由ApaF1 凋亡促进因子 l 介导的凋亡过程 释放的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路 未释放的细胞色素C用于维持电子传递和氧呼吸 为凋亡进程提供ATP 由于线粒体MPTP开放 细胞色素C大量释放 ATP产生骤减 无法维持供能 细胞走向坏死 65 Fig 2 TemporalandspatialorganizationofmitochondrialdepolarizationandcytocreleaseinducedbyC2 ceramide Ca2tandtBid FluorescenceimagingofDWmwascarriedoutsimultaneouslywithcytocdistributionincytoc GFP expressingandTMRE loadedHepG2cells Sequentialfluorescenceimagesareshownasgreen Fcytoc GFP red FTMRE overlays Depolarizationappearsasalossoftheredfluorescence whereascytocreleaseappearsasalossofthegreenfluorescence Cytoc GFPwasexpressedonlyinthreecellsthatareshownintheupperrightquadrant PermeabilizedcellswerepretreatedwithC2 ceramide 40lMfor5min beforeadditionofCa2t 50lMCaCl2 and subsequently tBid 25nM IntheabsenceofC2 ceramide arelativelysmallCa2t induceddepolarizationandnocytoc GFPreleasewereobserved notshown TheCa2t inducedmitochondrialdepolarizationinitiatedindiscretesubcellularregionsandpropagatedaswavesthroughcells directionofthewaveismarkedbythewhitearrowintheupperleftimage Timecoursesofthefluorescencechangesareplottedinthegraph 66 67 2 MPTP dependentintermitochondrialcalciumsignaling Ca2 m theopeningoftheMPTP releaseoftheaccumulatedCa2 subsequentlytakenupbyadjacentmitochondria Thismechanismmayresultinaregenerativeresponsethatspreadsthroughouttheentiremitochondrialpopulationofthecell Notably MPTP dependentintermitochondrialcalciumsignalinghasbeenreportedtorecruitmitochondriatotheapoptoticprocess 68 3 线粒体钙与活性氧 活性氧分子ROS 包括超氧阴离子 过氧化氢和羟