《细胞的研究方法》PPT课件.ppt

第三章细胞生物学研究方法 Cell 第一类研究方法 形态观察技术 第二类研究方法 生物化学分析技术 第三类研究方法 细胞生理学技术 第四类研究方法 其它实验技术 第一节细胞形态结构观察技术 一 普通复式光学显微镜 一 光学显微镜技术 光学放大系统 目镜和物镜照明系统 光源 折光镜和聚光镜机械和支架系统 保证光学系统的准确配置和灵活调控 1 普通光镜的结构 分辨率 指能区分开两个质点间的最小距离 其中 为入射光线波长 N为介质折射率 镜口角 样品对物镜镜口的张角 N sin 2为镜口率 对任何显微镜来说 最重要的性能参数是分辨率 D 0 61 N sin 2 思考 如何提高显微镜的分辨能力 放大倍数 显微镜的分辨率 人肉眼的分辨率 几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点 制作光学镜头用的是玻璃 所用介质的折射率越接近玻璃的越好 sin 2的最大值必然小于1 介质为空气 镜口率一般为0 05 0 95 油镜头用香柏油为介质 镜口率可接近1 5 空气中最短的可见光波长为450nm 镜口角最大值为140 分辨率约0 3 m 若为油镜 D为0 2 m 肉眼的分辨力为0 2mm 因此显微镜的最大放大倍数为1000X D 0 61 N sin 2 往往将标本固定 包埋 切片 染色 提高可辨程度 普通光学显微镜制片技术 1 荧光显微镜 二 特殊光学显微镜 荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 分裂细胞的免疫荧光图像 不同荧光染料 标记 抗体 特异性结合 免疫荧光技术 抗原 细胞的蛋白质成分 荧光素直接标记技术 用荧光素直接标记细胞中的某一蛋白 在荧光显微镜下就可以直接观察该蛋白的动态变化 使用两种以上的荧光素标记同一样品 标记荧光素的样品在荧光显微镜下经不同波长的激发光激发可发射出不同颜色的荧光 诺贝尔化学奖 神奇的荧光蛋白 美国华裔 钱永健日本 下村修美国 马丁 沙尔菲 2006年 我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪在东北农业大学的种猪场自然分娩产出 这标志着我国在转基因克隆猪技术领域已达到世界领先水平 激光共焦点扫描显微镜的原理图 2 激光共焦点扫描显微镜 LaserConfocalMicroscope LCM Q550MW型LCM 优点 排除焦平面以外光的干扰 增强图像反差和提高分辨率 1 4 1 7倍 利用光切片技术显示的花粉内部结构 3 相差显微镜 phasecontrastmicroscope 原理 光通过不同密度物质时滞留的时间不同 利用相位差 将厚度的差别转化成明暗的差别 增加反差 可用于观察活细胞 二 主要电镜制作技术 三 扫描隧道显微镜 一 电镜基本知识 二 电子显微镜技术 电镜问世的必然性 0 61 D N Sin 2 波长 N 介质折射率 物镜镜口角 标本在光轴的一点对物镜镜口的张角 放大倍数 显微镜的分辨率 人肉眼的分辨率 分辨率 resolution 是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力 通常是用相邻两点间的距离来表示 可通过公式换算出 一 电镜基本知识 各种光及电子束的波长 Ruska 1933 1938 便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限 发明了透射电子显微镜 transmissionelectronmicroscope TEM 电子显微镜与光镜的比较 电磁透镜 高真空 荧光屏 电子枪 电子显微镜与光镜的主要区别 由于电子束不能透过玻璃 因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0 05 m的超薄切片 并放在铜网上 这种切片需要用超薄切片机制作 1 超薄切片技术 二 主要电镜制作技术 固定 包埋 切片 染色 锇酸或戊二醛 环氧树脂 重金属盐 40 50nm 1 超薄切片技术 用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色 吸去染料 样品干燥后 样品凹陷处铺了一薄层重金属盐 而凸出处则没有染料沉积 从而出现负染效果 分辨力可达1 5nm左右 2 负染色技术 用磷钨酸钾染色 a 和铬镀膜后 b 的烟草rattle病毒电子显微图 将标本于 100 干冰中或 196 液氮中 超低温冰冻 然后用冷刀骤然将标本冲断开 升温后冰在真空条件下迅即升华 暴露出了断裂面结构 蚀刻 etching 冰冻蚀刻技术的操作步骤 freeze etching 3 冰冻蚀刻技术 蚀刻后 再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂 然后将组织溶掉 把碳和铂的膜剥下 此膜即为复膜 replica 复膜 复膜显示出了标本蚀刻面的形态 可置于透射电镜下观察 电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构 细胞冰冻断裂后的电镜图像 电子枪发射出的电子束作为 探针 在样品表面进行扫描 电子束激发样品表面放出次级电子 被电荷的探测器收集后 在荧光屏上相应位置显示出明 暗差别 用来观察标本的表面形态结构 scanningelectronmicroscope SEM 4 扫描电镜技术 扫描式电子显微镜 耳听毛的扫描电镜图像 一 超速离心技术 第二节细胞组分的分析方法 为了研究细胞的各种结构和成分的化学性质和生理功能 需要把它们分离和抽提出来进行研究 离心是研究细胞器和生物大分子的必要手段 离心机结构与原理示意图 离心分离技术 差速离心 密度梯度离心密度梯度离心与差速离心结合可达到更精细的分离 差速离心 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心 用于分离不同大小的亚细胞组分和各种颗粒 利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图 密度梯度离心 区带离心法 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部 通过不同颗粒之间存在沉降系数差时 在一定离心力作用下 颗粒各自以一定速度沉降 在密度梯度不同区域上形成区带的方法 密度梯度离心 速度沉降 用于分离密度相近大小不一的细胞组分 常用介质为蔗糖等密度沉降 用于分离不同密度的细胞组分 常用介质为氯化铯 常用的介质 蔗糖 氯化铯等 二 细胞化学技术 一 组织化学和细胞化学法 二 免疫细胞化学法 特异蛋白抗原的定位与定性 一 组织化学和细胞化学技术 组织化学和细胞化学染色方法依据化学反应原理 对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究 Feulgen反应 DNA苏丹染色 脂肪和胆固醇Millon反应 蛋白质 免疫细胞化学是根据免疫学原理 利用抗体同特定抗原结合 对抗原进行专一定位测定的技术 二 免疫细胞化学 immunocytochemistry 抗体与抗原的结合方法可分为以下两种 直接法 间接法 将带有标记的抗体与抗原反应 显示出抗原存在的部位 不同荧光染料 标记 抗体 特异性结合 免疫 荧光技术 抗原 细胞的蛋白质成分 不同荧光染料 抗体2 标记 不同荧光染料 三 细胞内特异核酸序列的定位与定性 一 DNA序列测定技术 主要利用的測序仪 二 核酸分子杂交技术 molecularhybridizationtechnique 三 PCR技术 聚合酶链式反应 二 核酸分子杂交技术 原理是两条具有互补序列的单链核酸分子片断 在适当的实验条件下 通过氢键结合 形成DNA DNA DNA RNA或RNA RNA双链分子的过程 1 原位杂交 insituhybridization 用来检测染色体上的特殊DNA序列 用已知的带有标记的特定核酸分子作为探针 来测定与之成互补关系的染色体DNA区段的位置 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 2 Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法 六种限制性内切酶酶切真鲷基因组DNA的电泳结果 A 和Southernblot B 杂交结果 箭头示杂交带 根据双链DNA的变性与复性和分子杂交原理设计出的技术 目的是将极微量DNA体外大量扩增 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction PCR的基本原理 高温变性 低温复性 中温延伸PCR三步曲 变性90 97 94 退火45 65 延伸72 左右 三 PCR技术 A DoublestrandDNA B Denature 94 C Annealprimers 50 D Polymerasebinds 72 Taq Taq Taq Taq 1 2 3 4 1 2 3 4 F Denature 94 1 2 四 放射自显影技术 原理及应用 利用同位素的电离辐射对乳胶的感光作用 对细胞内生物大分子进行定性 定位与半定量研究 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究 用于大分子合成过程研究的放射自显影技术 同位素标记示踪化合物 注入动物体内 取下器官或组织 切片 涂乳胶膜 自显影 显影和定影 染色 观察 五 定量细胞化学分析技术 一 显微分光光度测定技术 二 流式细胞仪 一 显微分光光度测定技术 原理 利用细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱 用来测定这些物质在每个细胞内含量的一种实验技术 核酸 260nm 蛋白质 280nm 细胞色素 维生素等都有自己特征性的吸收曲线 二 流式细胞仪 FlowCytometry 主要应用 用于定量测定细胞中的DNA RNA或某一特异蛋白的含量 测定细胞群体中不同时相细胞的数量 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞 流式细胞分选术 fluorescence associatedcellsorting FACS 细胞悬液 鞘液 液滴加电信号 探测器 超声波振摇器 加负电的液滴 加正电的液滴 细胞收集容器 细胞收集容器 废液容器 未探测细胞 流式细胞仪 FlowCytometry 主要介绍几种对细胞进行整体或局部进行手术处理的技术 这些技术在细胞工程领域中有很重要的应用价值 一 细胞培养技术 二 显微操作术 三 细胞融合技术 第三节其它实验性操作技术 一 细胞培养 活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动 否则就要死亡 因此 要进行体外细胞培养 就要尽可能满足细胞在正常体内生理状态下的各种条件 其中选择最佳培养基是最关键的因素 1 动物细胞培养 培养的动物细胞 几个概念 原代细胞 从机体取出后立即培养的细胞 传代细胞 适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞 细胞系 有少数细胞能传40 50代次 仍保持原来染色体的二倍性和接触抑制的行为 永生细胞系 有少数细胞在传到50代以后发生了遗传突变 带有了癌细胞的特点 可能在培养条件下无限制传下去的细胞 植物细胞培养最明显的特点是 可进行组织培养 由外植体生长出植株 不易无限传代和建立细胞系 2 植物细胞培养 1 外植体培养 诱发产生愈伤组织 如果条件适宜 尚可培养出再生植株 2 悬浮细胞培养 在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术 植物细胞培养大体有如下几种技术 3 原生质体培养 体细胞杂交 转基因等 4 单倍体培养 通过花药或花粉培养获得单倍体植株 二 显微操作技术 所谓显微操作技术 micromanipulation 就是在显微镜下 用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术 现在显微操作装置的设计越来越精密 已经有可能对细胞核进行解剖和注入微量物质 如核酸分子片段 NT 88NE N型显微操纵仪 日本Nikon 细胞显微解剖手术图解 三 细胞融合 真核细胞通过介导和培养 两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合 cellfusion 或细胞杂交 cellhybridization 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体 homokaryon 来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体 heterokaryon 目前诱导细胞融合的方法有三种 1 病毒介导