《续1λ噬菌体的调控》PPT课件.ppt

噬菌体的基因表达调控 噬菌体的调控有多种形式 有正调节 负调节 自主性的反馈调节 抗终止调节 反义调节及反向调节等 其机制之精巧 过程之复杂 形式之多样堪为集原核生物调控之大成 噬菌体是一种以大肠杆菌为宿主的温和型噬菌体 它感染大肠杆菌后 通过精确的基因表达调控机制选择裂解周期或溶原周期 噬菌体长48502nt 共61个基因 其中32个较为重要 一 Lamdaphage简介 的整个生命过程都离不开寄主的RNA聚合酶 因为 噬菌体没有编码RNA聚合酶的基因 DNA两条链都有遗传密码 有各自的转录单位向右转录的叫R链 向左转录的叫L链 Lytic threephases immediateearly delayedearlyandlate lysis Replicationofthelambdagenome productionofviralcoatproteins andassemblyofprogenyphage Lysogenic threephases immediateearly delayedearlyandlate lysogeny RepressorproteincIisproducedwhichbindstothetwooperatorregions ORandOL TranscriptionofalllambdagenesexceptcIisstopped Noprogenyproduced Phagegenomeintegratesintohostgenomeandbecomesprophage Notdisadvantageousforhost DNA的基因顺序组织如图所示 按基因组功能共分六大区域 头部编码区 尾部编码区 重组区 控制区 复制区和裂解区 它们分属四个操纵子结构 阻遏蛋白操纵子 早期左向操纵子 早期右向操纵子以及晚期右向操纵子 噬菌体的基因组结构 Bacteriophagelambdagenome png 图中OR1 2 3的顺序反了 WhencontemplatingIsuggestattentionbepayedtothefollowingconcepts 时间 空间 量 浓度 或然性temporal spatial amount concentration random toacertainextent DNA在宿主细胞环化后 由于DNA分子上没有任何调控蛋白存在 因此宿主的RNA聚合酶便分别结合于PL和PR 2 immediateearly Boththelyticandlysogenicpathwaysrequireexpressionoftheimmediateearlyanddelayedearlygenes WhenlambdaDNAentersanewhostcell thelyticandlysogenicpathwaysstartoffthesameway Figure12 12Phagelambdahastwoearlytranscriptionunits inthe leftward unit the upper strandistranscribedtowardtheleft inthe rightward unit the lower strandistranscribedtowardtheright GenesNandcroareseparatedfromthedelayedearlygenesbytheterminators SynthesisofNproteinallowsRNApolymerasetopasstheterminatorstL1totheleftandtR1totheright 或许这种抗终止机制的使用是为了保证细胞中一开始就累积一定量的Cro蛋白 2 1Lambdahasonlytwoimmediateearlygenes Nandcro N Ncodesforanantiterminationfactorwhoseactionatthenutsitesallowstranscriptiontoproceedintothedelayedearlygenes Cro Crohasdualfunctions BybindingtoOR OR3 itpreventssynthesisoftherepressorCIwithPRM ByinteractingwithOL OLl andOR ORl itturnsoffexpressionoftheimmediateearlygenes whicharenotneededlaterinthelyticcycle 包括自体调控 Cro浓度较高时 tworeplicationgenes neededforlyticinfection sevenrecombinationgenes someinvolvedinrecombinationduringlyticinfection twonecessarytointegratelambdaDNAintothebacterialchromosomeforlysogeny andthreeregulators cII cIII Q 位置较靠后 3 delayedearlystage Thedelayedearlygenesinclude Thethreeregulatorshaveopposingfunctions ThecII cIIIpairofregulatorsisneededtoestablishthesynthesisofrepressor lysogen TheQregulatorisanantiterminationfactorthatallowshostRNApolymerasetotranscribethelategenes lytic CIICIIisatranscriptionactivator Itactivatestranscriptionatthreepromoters PRE PIandPaQ 活化PRE 产生阻遏蛋白CI 稍后进一步介绍 活化整合酶启动子PI 由PI起始的mRNA在int基因末端后面约300nt的终点子处停止转录 由PI转录的mRNA较为稳定 虽然int基因也可以由启动子PL起始转录 但产生的intmRNA会被细胞中的核酸酶所降解 并不能产生整合酶 因为由启动子PL起始转录 RNA聚合酶经过N抗终止蛋白的修饰可以通过终止子tL2 这样RNA得以延伸 形成了核酸酶的靶位点sib 它首先被RNase 剪切 接着核酸外切酶从3 5 降解mRNA sib是int基因下游的负调节位点 降解由下游向上游方向进行 故称其为反向调节 retroregulation 活化PaQ TranscriptionfromPaQmakesashort60ntself terminatingtranscriptwhichfunctionsinANTISENSEcontrolofQexpression InordertobecomeestablishedasalysogeninE coli bacteriophagelambdamustdotwothings repressormustbesynthesizedthephagemustbecomeintegratedintothehostchromosome PleaseRemember Conclusion CIIisessentialforlysogeny Withoutit orwithoutenoughofit lysogenicgrowthisnotpossible CIII achaperoneproteinthatprotectsCIIfromhostproteasesCIIalonehasahalf lifeof 1min InthepresenceofCIII CIIhasahalf lifeof 5min QAntiterminatoroftR4 allowstranscriptionfromPR2 alsocalledPR toproceedthroughtotR5 thustranscribingallofthelatelambastructuralgenesrequiredforphageassembly ButatthisstageQmaynotexistbecauseCII 基因位置在Q基因之前 activatesPaQ 维基也解说为NoQ Lambdaimmediateearlyanddelayedearlygenesareneededforbothlysogenyandthelyticcycle 晚早期基因包括2个复制基因 裂解感染所需的 7个重组基因 有的和裂解感染中的重组有关 其中有2个是 DNA整合到细菌染色体中所必需的 及3个调节基因 c c Q 启动子PL和操作子OL部分重叠 4 latelysogeny CI操纵子cI基因编码的CI阻遏蛋白 分别作用于早期左向操纵子和早期右向操纵子中的操作子OL和OR 阻止这两个操纵子转录 CI阻遏蛋白CI阻遏蛋白操纵子与 噬菌体溶原状态的确立与维持密切相关 cI基因突变的 噬菌体在生长着大肠杆菌的固体培养基上总是形成清晰的噬菌斑 该基因由此得名 Lysogenyismaintainedbyrepressorprotein Aresultofcooperativebindingistoincreasetheeffectiveaffinityofrepressorfortheoperatoratphysiologicalconcentrations Thisenablesalowerconcentrationofrepressortoachieveoccupancyoftheoperator 阻遏蛋白操纵子含有一个结构基因 cI基因 但有两个启动子 PRE 阻遏蛋白建立溶原状态 PRM 阻遏蛋白维持溶原状态 Thesubscript RE standsforrepressorestablishment RMforrepressormaintainment 由PRE控制转录的mRNA分子中含有一个有效的核糖体结合位点 mRNA的翻译活性比PRM介导的转录产物高7至8倍 PRE缺少 35区保守序列 10区序列也不保守 ThispromotercanberecognizedbyRNApolymeraseonlyinthepresenceofcII CII蛋白在细胞内很不稳定 极易被宿主蛋白酶HflA降解而失去活性 而CIII蛋白的功能则是保护CII蛋白免遭降解 PRE CIisexpresseddirectly Oncetheproteinstartstoaccumulateinthecell itwillactivateitsowntranscriptionasaresultofbindingtoORtoactivatePRM SincethemRNAtranscribedfromPREcontainsananti sensecopyofthecromRNA expressedfromPR thetwomRNA scanhybridizewithoneanother Thiswillsequesterthecrocodingregioninadouble strandedRNAstructurewhcihcannotbetranslated ActivationoftranscriptionfromPREservestwofunctions 由PRE介导的转录除了能直接表达cI基因外 还有一个间接功能 即同时转录出cro基因的反义RNA 与cro的mRNA互补杂交 从而阻断其翻译 而Cro是噬菌体进入溶菌状态所必需的 由PRM启动的cI基因转录以起始密码子AUG开始 转录产物上没有核糖体结合位点 因此cI基因的表达量很低 TotranscribecI theremustberepressoritselfpresent 当 DNA分子进入一个新的宿主细胞时 因为没有CI蛋白因子 宿主的RNA聚合酶并不能由启动子PRM转录cI基因 PRM 在晚早期基因产物CII的帮助下 cI基因得以表达 cI阻遏蛋白分别与OL和OR两个操作子结合 CI通过阻止两个早期操纵子的转录 既关闭了溶菌途径 又通过PRM维持了自身在宿主细胞中的一定水平 噬菌体溶原状态的建立与维持 Facedwiththetriplicationofbindingsitesateachoperator howdoesrepressordecidewheretostartbinding TherepressoralwaysbindsfirsttoOL1andOR1 Lambdarepressorbindstosubsequentsiteswithineachoperatorinacooperativemanner Thepresenceofadimeratsite1greatlyincreasestheaffinitywithwhichaseconddimercanbindtosite2 Whenbothsites1and2areoccupied thisinteractiondoesnotextendfarther tosite3 Attheconcentrationsofrepressorusuallyfoundinalysogen bothsites1and2arefilledateachoperator butsite3isnotoccupied Acontrolcircuit solongasthelevelofrepressorisadequate thereiscontinuedexpressionofthecIgene TheresultisthatOLandORremainoccupiedindefinitely Byrepressingtheentirelyticcascade thisactionmaintainstheprophageinitsinertform 小结 由PRE控制转录产生CI后 PL和PR被抑制 早期基因的表达将受阻 C 和C 缺乏 CI通过PRE的转录也停止 所以cI基因转录的起始需要CII 转录的维持需要CI本身 如果此时第二个噬菌体感染这个溶原化的宿主细胞 由原噬菌体基因组合成的阻遏蛋白便会迅速与新入侵的噬菌体基因组上的OL和OR结合 防止该噬菌体启动溶菌途径 这就是所谓的宿主细胞免疫现象 由OL OR cI以及cro基因组成的区域决定了噬菌体的免疫特性 因此也称为免疫区 具有同一免疫区的不同噬菌体存在交叉免疫活性 5 LatelysisDuringlyticgrowth lategeneexpressiondependsinpartontheactionoftheQprotein whichisanantiterminatorwhichallowsRNApolymerasetoover ridetheterminationsignaldownstreamofPR sothatitcantranscribethelysisgenes S RandRz andthecapsidproteinandprocessinggenes Nu1 A Wetc 晚期右向操纵子最大 它包括10个头部蛋白编码基因 11个尾部蛋白编码基因 A J 以及3个负责裂解宿主细胞的溶菌酶类基因S R和Rz 其所需启动子为PR 晚期右向操纵子 LysisplaquesoflambdaphageonE colibacteria TheQproteinactsatthelevelofDNA unliketheNprotein ItbindstothequtsitewithinthePR promoter RNApolymeraseinitiatingtranscriptionfromPR reachesapausesitelocated16 17bpsdownstreamofthetranscriptionstartpoint Immediatelyupstreamofthispausesiteisasecond 10region TTGACT 17 TAATT AACGTT Thelyticcycledependsonantitermination WhenRNApolymerasepauses Qinteractswiththepausedcomplexbybindingtothequtsite Qthendisplaces 70fromtheelongatingcomplexandchangesitsterminationproperties Lysogenyensuesifsynthesisoftherepressorisestablished lyticdevelopmentfollowsifthelategenesareexpressed 6 溶源还是溶菌 CIrepressorisneededforlysogeny Crorepressorisneededforlyticinfection Cro亦是一种负调节因子 作用位点也是OR和OL Cro与操纵子的结合能关闭两个早期操纵子 但同时也阻止了启动子PRM的转录启动 阻碍溶源建立 cromutantsusuallyestablishlysogeny becausetheylacktheabilitytoswitcheventsawayfromtheexpressionofrepressor Cro和CI是 噬菌体的两种调节蛋白因子 它们虽然都作用于OR和OL两个操作子 但对每个操纵子中三个不同位点的亲和力次序不同 CI的亲和力次序是OLl OL2 OL3 ORl OR2 OR3 Cro恰好相反 为OL3 OL2 OLl OR3 OR2 ORl Cro和CI有何不同 CrobindsfirsttoOR3 ThisinhibitsRNApolymerasefrombindingtoPRM SoCro sfirstactionistopreventthemaintenancecircuitforlysogenyfromcomingintoplay ThenCrobindstoOR2orOR1 ItspresenceateithersitepreventsRNApolymerasefromusingPR Thisinturnstopstheproductionoftheearlyfunctions includingCroitself BecausecIIisunstable anyuseofPREisbroughttoahalt SothetwoactionsofCrotogetherblockallproductionofrepressor Cro破坏溶源 Sofarasthelyticcycleisconcerned Croturnsdown althoughitdoesnotcompletelyeliminate theexpressionoftheearlygenes ItsincompleteeffectisexplainedbyitsaffinityforOR1andOR2 whichisabouteighttimeslowerthanthatofrepressor ThiseffectofCrodoesnotoccuruntiltheearlygeneshavebecomemoreorlesssuperfluous becausepQispresent bythistime thephagehasstartedlategeneexpression andisconcentratingontheproductionofprogenyphageparticles Cro开始抑制早期基因时 早期基因的表达产物已经多余了 Cro与溶菌 Figure12 31ThelyticcascaderequiresCroprotein whichdirectlypreventsrepressormaintenanceviaPRM aswellasturningoffdelayedearlygeneexpression indirectlypreventingrepressorestablishment Cro蛋白作用于操作子OL 关闭早期左向操纵子 阻断CII和CIII蛋白的持续合成 当原先合成的CII和CIII蛋白被降解 导致 CII蛋白因子对PaQ激活作用解除 pQ大量合成 pQ也是一种抗终止蛋白 促进晚期操纵子在启动子PR 的作用下进行转录 表达出足够数量的头部尾部包装蛋白以及裂解宿主所必需的溶菌酶系 至此噬菌体进入溶菌途径 噬菌体溶原状态与溶菌状态的选择 噬菌体溶原状态与溶菌状态的确立均依赖于早期基因的有限度表达 溶原状态建立的起始事件是阻遏蛋白CI与OL1和ORl结合 进而关闭cro基因的表达 并同时启动由PRM介导的CI合成 进入溶菌途径的首要条件是Cro蛋白因子与OR3结合 打破由PRM介导的溶原维持 然后再作用于ORl或OR2以及OLl或OL2 关闭两个早期操纵子 通过阻断CII和CIII的合成而终止由PRE介导的CI合成 因此 决定 噬菌体建立溶原状态或进入溶菌途径的开关是CI或Cro对操作子OL和OR有利位置的占领 Cro的合成早于CI 然而 CI对OL和OR的亲和力比Cro蛋白高约8倍 如果CI和Cro两种蛋白同时存在 则Cro必须以分子数的优势才能赢得竞争 如果CII蛋白有足够的活性 则PRE启动cI基因转录 合成的CI分子使得PRM更有效地表达cI基因 进入溶源 反之 Cro蛋白便依其数量优势占据OL和OR 噬菌体进入溶菌途径 可见 任何有利于CII基因表达并使其产物稳定的因素均可导致 噬菌体建立和维持溶原状态 这些因素包括营养枯竭以及感染复数等 Thehealthofthehostcelldeterminesthefateoflambda Ifthecellishealthy sufficientenergyisavailableforproductionofprogenyphageandlambdawillgolytic Ifthecellisunhealthy lambdawillgolysogenic 当宿主陷入能源枯竭的境地时 细胞内相应发生一系列的生理变化 其中主要的是cAMP的大量合成 cAMP CAP复合物进而抑制宿主细胞宿主蛋白水解酶基因hfl的表达 hflA和hflB基因又称高频溶原基因 CII蛋白的不稳定性就是这个酶系作用的结果 因此 能源枯竭的环境条件有助于噬菌体CII蛋白活性的维持 从而保证CI阻遏蛋白的合成 使得噬菌体建立溶原状态 事实上由于能源不足 噬菌体也不可能通过溶菌途径而大量繁殖 上述过程实质上是噬菌体把握环境条件对其自身生长繁殖的一种调节机制 感染复数指的是在感染时噬菌体数与细菌细胞数的比值 它对溶原状态建立的影响也是通过CII蛋白而起作用的 感染复数与CII蛋白的活性形成有关 CII蛋白的单体没有活性 只有寡聚体才有作用 当感染复数过低时 多个噬菌体同时感染一个宿主细胞的机会也就减少 所表达的CII产物不足以形成有活性的寡聚体 此时 噬菌体便进入溶菌途径 当感染复数过高时 通常大于10 CII能形成足够数量的活性寡聚体 就可促进由PRE介导的cI基因转录启动 该转录产物的翻译活性远高于从PRM转录出的mRNA 因此CI蛋白数量很快占据优