生物技术药物研究进展

生物技术药物 研究进展,一. 概况：,以基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程为主体的现代生物技术近几年来发展极其迅速，是影响国民经济的四大科学支柱之一(微电子、生物技术、新型材料和航天技术)，被认为是21世纪科学技术的核心，而以基因工程为主的医药生物技术则是生物技术领域最为活跃、发展最为迅速的部分，目前世界各国，特别是美国，日本，欧共体国家均把优先发展生物技术定为国策，美国参议院宣布2000年1月为“美国国家生物技术月”，2025年美国生物技术市场将达到2万亿美元，届时将占国民生产总量(GDP)的20；日本则认为作为资源小国，发展生物技术是持续发展石油、电子、航空工业之后，21世纪可持续发展的最大和有效途径之一。,生物技术药物定义： . 利用生物技术生产的生物体内活性物质。(广义) .利用现代生物技术发现、筛选或生产得到的药物不仅 限于体内活性物质，也包括筛选获得的小分子药物 (更广义).基因重组的蛋白分子药物(狭义)(一) 国外：2004年，美国生物技术药物销售额占全球58，欧州市场分额为22；日本近年较滞后，销售额徘徊在20-30亿美元，占9；其他国家为11。和美国等国家相比，我国对生物技术药物的研发、生产均有较大差距。,至2004年12月31日美国FDA共批准生物技术药物84种，其中：1.大肠杆菌表达的20种：包括甲状旁腺素；利尿钠肽；胰岛素及其4种突变体；生长激素；干扰素-2a、-2b 、 -1b、；G-CSF；白细胞-1Ra；白介素-1、-2、-11；tPA;白喉毒素-IL-2融合蛋白；OspA脂蛋白、角化细胞生长因子KGF等。2.酵母表达8种：尿酸水解酶(rasburicase)、胰高血糖素、 GM-CSF、血小板衍生生长因子(rhPDGF-BB)、乙肝疫苗、胰岛素(Novolin)及其突变体(NovoLog)、水蛭素等。3.晡乳动物表达56种：激素6种：人生长激素、促滤泡素 、人绒膜促性腺激素、促甲状腺素、促黄体素。酶7种：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、粘多糖- -L艾杜糖醛酸水解酶、葡萄糖脑苷脂酶、半乳糖苷酶、DNA酶、,tPA突变体TNK- tPA等。细胞因子7种：干扰素-N3、 -n1、-1a; EPO- 及其突变体(Aranesp)骨形成蛋白2。凝血因子5种：凝血因子VIIa、VIII(BHK表达)、 VIII(CHO表达recombinate rAHF)、 VIII (CHO表达 ReFacto)、凝血因子IX。治疗抗体18种：Avastin,Bexxar,Campath,Erbitux,Herceptin,Humira, Mylotarg,Orthoclone OKT3, Reptiva,Remicade,ReoPro,Rituxan,Simulect,Synagis,Tysabri,Xolair,Zenpax。体内诊断用抗体6种：CEA-Scan,MyoScint,OncoScint,ProstaScint,Verluma,NeutroSpec。组织工程产品4种：组织工程皮肤3种Apligraf、Dermagraft、OrCel；组织工程软骨Carticel。,表1 2004年后FDA批准的生物技术新药,(二). 国内： 我国医药生物技术起步较晚，基础较差，但是由于政府的高度重视，因此发展很快，经过从“七五”到 “十五”的发展，我国医药生物技术产品的研究、开发和产业化已初具规模，目前国内生产基因工程药物的厂家有30余个，已取得一批较重要成果，至2004年已有二十九种基因工程药物和疫苗上市，它们是干扰素(interferon -2a， -2b， -1b* 和 ) ；白细胞介素2(IL-2)、125AlaIL-2、125ser IL-2；促红细胞生成素(EPO)；人胰岛素；生长激素(HGH)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；链激酶(SK*)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF*)包括人及牛bFGF 融合蛋白；葡激酶SK；白细胞介素-11；表皮生长因子EGF及其衍生物；rh TNF ;,脑钠肽；抗IL-8鼠源单抗乳胶剂(银屑病)；抗CD3鼠源单抗(器管移植抗排斥)；131肿瘤细胞核嵌合抗体注射液（实体瘤）；乙肝疫苗；痢疾疫苗；霍乱疫苗；p53重组腺病毒注射液(肿瘤)；抗HER-2人源化单抗(乳腺癌)。其中干扰素-1b、链激酶、葡激酶、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、125AlaIL-2、 125SerIL-2、抗IL-8鼠源单抗乳胶剂、 131肿瘤细胞核嵌合抗体注射液、痢疾疫苗、霍乱疫苗、p53重组腺病毒注射液为I类新药(12种)。 据了解至2004年，我国已申报中检所和正在进行临床研究的生物技术药物，基因重组产品约40余种；疫苗4种；抗体类5种；基因治疗药物8种；体细胞治疗产品4种。 和国外相比，我国在本领域差距较大，其中原因很多，,据分析主要问题在于我国生物制药产业化核心技术水平低，特别是动物细胞大规模高效表达培养水平较差，成为生物制药发展的最大障碍。随着我国经济的快速发展，我国已跻身于全球大药品销售市场之一，虽份额仅占世界1.3，但年增长率达19%这将为我国生物制药发展提供巨大的空间。,表2. 至2004年 我国批准上市生物技术药物,2004年全球销售额前五名的生物技术药物 商品名 销售额 (百万美元) 年增长额 公司 EPO- 6410 -2.9% Johson & Johson, Amgen抗CD20嵌合抗体 2965 28 Roche3.G-CSF/PEG- G-CSF 2915 16% Amgen4. 胰岛素 2624.3 -0.7% Novo Nodisk 5.TNF- R Fc融合蛋白 2580 61.2% Amgen,据统计至2004年底，全球生物制药产业市场达450亿美元。1998-2004年生物技术药物年销售额增长为15-33，显著高于传统药物7-10。 资料显示，2004年全球销售生物技术药物584种，其中销售前50位产品为340亿美元，占总销售额90.5，而前十种占有额达50%。,表3. 全球十大药品市场 (2003.6-2004.6),图1.全球生物技术药物年销售额增长曲线,图2. 2003年不同类别生物技术药物年销售额,图3. 生物技术药物年销售额及动物和微生物细胞表达产品比例,图4. 生物技术药物的10个主要生产国,二.医药生物技术发展的趋势：(一).人类基因组及后基因组研究：1.人类基因组研究： 人类基因组计划是人类生命科学史上最伟大的工作之一，人类基因组是指合成有功能的人体各类细胞中蛋白质及多肽链和RNA所必须的全部DNA序列和结构，包括人类的23对染色体上全部DNA所携带遗传信息的总和；即30亿个碱基对的序列。2000年6月26日，参加人类基因组计划国际协作组的各个国家同时宣布，人类基因组核苷酸序列的“工作框架图”已完成，测序工作进入全面完成人类基因组的最后阶段，2001年2月15日“Nature”杂志公布，确定人类基因组中只有1为编码基因，基因数目为26500-30000。,我国先后于1993年和1997年启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构与功能研究”项目，在上海和北京相继成立了国家人类基因组南、北两个中心，1999年7月，中国科学院遗传所人类基因组中心在国际人类基因组HGSI注册，承担了其中1，即3号染色体短臂自D3S3610标志至端粒区段3000万个碱基的测序任务，使我国成为继美、英、德、日、法后第六个参与该计划的国家，也是唯一的发展中国家。目前已如期完成框架图工作。国内研究重点放在功能基因组学，包括致病基因、疾病相关基因及具有重要生物功能基因的分离、克隆和功能研究。在遗传致病基因、白血病、肝癌、鼻咽癌等肿瘤相关基因、造血干/祖细胞、下丘脑-垂体-肾上腺轴系统、胎肝、心血管和神经系统等组织cDNA方面达到国际前沿水平，共发现新基因的全长cDNA1000条以上，首次发现神经性耳聋疾病基因GTB3；发现了牙科遗传病乳光牙基因。,在建立西南、东北地区12个少数民族及南、北两个汉族人群永生细胞库基础上，进行了我国多民族、基因组多样性比较研究。,此外，有关模式生物基因组研究已完成了基因组序列分析的有30种以上细菌病原菌及与工业和基础研究有关的细菌，如1996年4月完成了酵母全序列测定；1997年9月完成了大肠杆菌序列测定，2000年完成果蝇的全序列研究，值得指出的是，我国率先完成了痢疾杆菌的全序列测定，此外，还对我国发现的新菌种腾冲耐热菌完成了基因组全序列测定，2002年我国还完成了水稻基因组全序列的测定工作，获国内外好评，在国际性前沿研究中争得一席之地。,表4. 微生物基因组测序进展(2001,8),目前国际人类基因组计划的主要研究内容为：(1).克隆和测定人类及模式生物(特别是小鼠)的全长 c DNA序列。(2).开发和完善DNA序列整合，分析以及表达基因识别的软件。(3).开展第三代遗传标记单碱基多态性遗传(SMP)标记研究，用于人类基因组多样性，药物基因组学研究和识别，定位疾病相关基因等。(4).继续研究由于基因组计划带来的社会、伦理和法律等问题。,2后基因组研究： 随着人类基因组序列测定的完成，后基因组研究已经启动，其核心是要破译天文数字般的DNA信息所编码的蛋白质功能，及人类基因组序列非编码区的调控功能，近年来已形成了若干新的分枝学科：,(1). 功能基因组学：(Functional Cenomics) 其中包括： A. 生物芯片： 利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术使样品检测、分析过程连续化、集成化、微型化。生物芯片主要包括芯片实验室(Lab-on-a-chip)、基因芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray)、蛋白芯片(Protein chip)。基因芯片又称为DNA芯片(DNA陈列)，是指用于DNA高密点阵的杂交技术，可以适用于检测基因表达水平，发现新基因，检测基因多型性。基因芯片是生物芯片中最先实现商品化的产品，目前比较成熟的产品有检测基因突变的芯片，检测细胞基因表达水平的表达基因芯片。美国Affymetrix公司是世界上最有影响的基因芯片开发制造商，1998年生产出带有13.5万个基因探针的芯片，使人类DNA解码速度提高了25倍，目前已达到密度为40万种探针/芯片，每种探针室间尺寸为10-20微米。,我国于2000年1月首次举办了专题为“生物芯片技术”的论坛。上海细胞所1999年8月在上海开发成功生物芯片的初级形式“cDNA陈列”,已建立了含有8000个人类基因的芯片,在肝癌研究中获得满意结果，西安已创建生物芯片科研生产基地，北京以清华大学牵头成立了包括医科院在内的“生物芯片北京国家工程研究中心”。,B. 硅生物学(Silicobiology) 利用生物信息学和计算机技术进行基因及非编码区的鉴定及功能分析。 C. 结构基因组学：(Structure Genomics) 利用计算机和非计算技术结合分析蛋白质晶体衍射数据，以确定其折叠立体结构等。 D. 基因删除：(Gene Knockout)： 利用小鼠胚胎干细胞在体外改变其基因后，形成某种突变基因鼠与野生型鼠比较，以确定基因功能。 E. 蛋白质组学： 由于生物功能主要体现为蛋白质，因此不仅要从基因角度，而且还应从蛋白质层次研究相关基因的结构和功能，建立蛋白质结构数据库。,主要研究人的基因多态性或突变如何影响药物效果及安全性。是药物遗传学与基因组学融合而产生的新学科，研究患者遗传背景差异与药物药理效应和毒副作用的关系，并利用人类基因组数据库资料，确定药物靶位，筛选先导化合物，设计体内外药理毒理试验和临床方案。,(2). 药物基因组学(Pharmacogenomics),基因组和后基因组研究所获得的巨大进展，为新药研究提供了极其广阔的前景：A. 新基因的发现及其功能研究，可以提供许多新型基因工程药物： 1998年 6月美国第一个基因组药物髓样造血细胞抑制因子-1(MP1F-1)已进入II期临床，第二个基因组药物角脘细胞生长因子-2(KGF-2)也于98年8月进入临床II期研究，2004年12月美国FDA已经批准KGF上市，用于治疗血癌化疗引起的口腔粘膜粘膜炎。美国HGS公司1999年2月宣布在12000种人类分泌蛋白中克隆了9000个全长cDNA，其中3000个基因可能有潜在医学应用前景，有35种新的白细胞介素和40种新生长因子。,B.为新药研究提供了广阔天地： a确定真正的药靶： 疾病相关基因 5000-10,000个分子药靶，为以往 的10-20倍。 b建立高通量筛选体系： 高度自动生物芯片, 筛选样品：从占多个样品 占十万个样品/周。,c.建立庞大的药物筛选库： 3000-10,000可溶性蛋白； 组合化学库；反义寡核苷酸；肽核酸。 d. 推动药物基因组研究： 指导合理因人用药，发现与基因功能相关的新药靶位。 e. 在人类基因组信息学， 病理基因组信息学研究基础上阐明侵染性、致病性和免疫学机理，从而促进新药和疫苗的开发。,基因工程药物是指利用基因工程技术研制和生产药，包括有重组蛋白药物、反义核酸药物、DNA药物和基因工程抗体、基因工程疫苗等,是医药生物技术领域中发展最快的部分，且已取得显著进展。,(二).基因工程药物：,1人促红细胞生成素(Erythropoietin EPO) 是一种糖蛋白，由165个氨基酸组成，结构中有4个半胱氨酸，分子量30400，其生物活性与糖基化相关，因此不能在大肠杆菌体系表达，目前EPO主要在中国仓鼠细胞(CHO)进行表达。 EPO是人体重要的造血生长因子，它刺激红血球原始细胞分裂和分化。成人EPO主要由肾合成，约515来自肾外，正常人血浆中EPO水平为0.010.03微克/毫升。EPO主要治疗下列疾病：(1).肾功能衰竭所致贫血。(2).癌性贫血。(3)结缔组织贫血。(4)骨髓增生性异常综合性贫血。(5)可以替代血浆。(6)对某些病人手术前使用，促进自身造血。(7)艾滋病贫血。本品种是全世界最畅销药物之一,1997年销售额即达35亿美元。,基因工程药物目前已经上市并在临床应用的主要品种如下：,由166个氨基酸组成，含5个半胱氨酸，分子量19392道尔顿，以大肠杆菌为表达体系。本品有广谱抗病毒活性，主要用于治疗乙型和丙型肝炎,是治疗丙型肝炎的首选药。此外可用于治疗毛细胞白血病，对疱疹、宫颈炎、红眼病和尖锐湿疣等，局部用药效果显著。 本品种由工程院院士候云德教授等首创，为我国拥有知识产权的I类新药。,2干扰素(Interferon),干扰素是一组多功能的细胞因子，根据其结构可以分为三类：，。目前临床应用的干扰素主要品种如下：,(1).干扰素 lb：,(2).干扰素 2a： 是由165个氨基酸组成的单糖多肽，有两对二硫键，表达体系是大肠杆菌。 本品临床主要用于治疗毛细胞白血病；卡波济氏肉瘤；多发性骨髓瘤，肾癌和慢性白血病等。此外本品还有调节免疫的能力，可用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎。,(3)干扰素2b： 本品由165个氨基酸组成，和干扰素2a仅差一个氨基酸，二者性质和用途类似，在大肠杆茵中进行表达。主要用于治疗多发性骨髓瘤；卡波济氏肉瘤；毛细胞白血病及乳头状瘤等。,(4)干扰素 由143个氨基酸构成，分子量16775道尔顿，和干扰素，在氨基酸水平上差异达99%，分子内没有二硫键，是一种糖蛋白，但糖基化与生物活性无关，表达体系为大肠杆菌，本品主要用于治疗类风湿性关节炎；宫颈癌；生殖器疣；慢性肉芽肿及病毒感染等疾病。,3白细胞介素类(Interlukin) 介导白细胞间相互作用的一类细胞因子命名为白细胞介素，目前发现种类己超过20种，新类型仍在不断发现中，已经批准上市销售用于临床的为以下两种：,(1)白细胞介素2： 是糖蛋白，由133个氨基酸组成的单链多肽，分子中有一个二硫键，对生物活性十分重要。分子量15000-17000道尔顿，采用大肠杆菌体系进行表达。本品临床主要作用是激活免疫效应细胞和产生协同效应因子，共同有效清除肿瘤细胞和病毒及细茵感染细胞，起到防病治病作用，可用于治疗黑色素瘤、肾细胞癌，对白血病也有一定疗效，也可用于治疗肝炎、分枝杆菌和真菌感染。 本品在体内半衰期短，毒性大，为此将天然白细胞介素2的125位胱氨酸通过点突变改为丝氨酸，这种新型白细胞介素2活性提高，对热稳定，体内半衰期延长，由于用量降低，因此减少了毒副作用，其临床适用范围与天然白细胞介素2相同。,(2)白细胞介素11 美国1997年批准上市销售，是第一个促血小板生成的细胞因子药物，由178个氨基酸组成，分子量19144，在大肠杆菌进行表达，临床主要用于肿瘤病人放化疗后血小板降低症。,4集落刺激因子类： 集落刺激因子(Colony stimulating Factors)是一组控制粒细胞、单核巨噬细胞和某些有关造血细胞的繁殖和分化的糖蛋白。目前己用于临床的主要有两个品种：(1)粒细胞集落刺激生长因子(GCSF)：本品由174个氨基酸组成，分子中有5个半胱氨酸，糖基化后分子量为20000，其表达体系为中国仓鼠细胞(CHO)，表达产品有糖基化，如以大肠杆菌表达，产物为非糖基化，但具有生物活性。 本品在临床主要适用于：癌症化疗后引起的中性粒细胞缺乏症，可促进白细胞和中性粒细胞恢复，减少感染保证化疗正常进行。此外还可用于：骨髓移植时促进中性粒细胞增加；骨髓发育不良引起的嗜中性白细胞缺乏症；再生障碍性贫血伴随嗜中性白细胞缺乏症；先天性特发性嗜中性细胞缺乏症。,(2)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子：(GM-CSF) 由144个氨基酸组成，分子量为14.5-35KD。基因工程GM-CSF主要由大肠杆菌表达。 本品在临床主要用于肿瘤化疗导致的造血障碍，此外还可用于治疗艾滋病以增加患者外周血中性粒细胞数目；骨髓移植，以加快骨髓造血重建。本品种还有免疫增强作用，促进单核巨噬细胞生成。,5组织纤溶酶原激活剂(Tissue Plasminogen Activator TPA) 本品属丝氨酸蛋白酶，由二硫键连接的两条肽链组成，其中A链含278个氨基酸(重链分子量36000)，B链由253个氨基酸组成，(轻链，分子量32000)，其生物活性与糖基化有关，因此主要在中国仓鼠细胞(CHO)中进行表达。 本品种用于活化纤溶酶原，临床主要用于救治急性心肌梗塞病人；急性肺梗塞；此外也可用于治疗异体肾移植后排斥作用、肾病综合症及下腔静脉血栓形成等疾病。,6胰岛素(Insulin) 是由胰腺分泌的一种蛋白激素，分子由A链和B链两条肽链组成，A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸，两条链间由两个二硫键相连，分子量为5.784KD。表达体系为大肠杆菌和酵母。 本品种临床主要用于治疗糖尿病，对于因胰岛素分泌不足导致葡萄糖利用减弱，迫使组织利用蛋白质和脂肪作为能源补充因而出现血糖和尿糖浓度升高的病人使用胰岛素治疗显著。,7人生长激素：(HGH) 是由人脑垂体前叶分泌的一种非糖基化蛋白激素，由191个氨基酸组成，含4个半胱氨酸形成两个二硫键，分子量21500道尔顿，由大肠杆菌表达。 人生长激素在人体发育中起重要作用，本品种临床用于治疗儿童自发性垂体性侏儒症，此外也可用于治疗代谢障碍、严重烧伤、伤口愈合、骨折、骨质疏松、出血性溃疡特纳氏综合肌肉萎缩等症。,8第VIII凝血因子(FVIII) FVIII因子(凝血8因子)是分子量约30万的糖蛋白，血友病是一种遗传性疾病，病人缺乏这种因子，因此必须经常注射人血源的FVIII因子。基因工程FVIII因子在中国仓鼠细胞中进行表达，临床主要用于治疗血友病病人。,9肿瘤坏死因子可溶性受体(Etaercept) 美国FDA于1998年11月批准上市商品名为Enbrel，目前主要用于治疗类风湿性关节炎，是用于该疾病治疗的第一个基因工程药物。肿瘤坏死因子(TNF)是与炎症相关的重要细胞因子之一，只有经过与其受体特异结合后才能具有生物活性，TNF有两种受体TNFR1和TNFRII，分别命名为TNFR55和TNFR75，两种受体细胞膜外的部分与配基TNF结合，由于蛋白酶水解等诸多原因胞外受体部分可以脱落而存在于人体体液中，称之为可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)，sTNFR具有和正常受体胞外部分同样与配基TNF结合的能力，通过sTNFR和TNFR竞争性结合TNF，可以降低体内TNF的生物活性，起到受体拮抗剂的作用，达到缓解炎症、类风湿性关节炎的目的。,本品是一种融合蛋白，由2分子sTNF75和1分子人的免疫球蛋白IgG Fc片断融合，与TNF结合力高于TNF单抗近千倍，对TNF活性有显著抑制作用，由于体内以Ig形式存在，因此稳定性强，1分子本品可与两分子TNF结合，且同时抑制TNF和TNF。 本品由934个氨基酸组成，分子量150,000，由CHO细胞表达，由美国Immunex及Wyeth-Ayerst Laborato ries公司共同开发生产,10.基因重组白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)： 本品于2001年11月 在美国经FDA批准上市，商品名为Kineret（anakinra）。与存在于人体的天然白细胞介素1受体拮抗剂IL-1ra 不同在于N 端加了一个甲硫氨酸残基。由153个氨基酸组成，分子量1.75kDa, 在大肠杆菌体系进行表达。 研究表明IL-1是人体炎症的关键细胞因子之一，IL-1ra通过和IL-1竞争性与IL-1R1结合，从而阻断IL-1在体内的生物活性，因此可对与IL-1相关的疾病起治疗作用。目前临床主要用于治疗18岁以上中度和严重类风湿性关节炎病人。 该品由美国Amgen公司和Thousand Oaks,C.A.公司生产。,以上为国内外已经在临床应用的主要基因工程活性蛋白药物，与化学合成药物、天然药物、中药相比，基因工程药物具有如下突出优势：(1)采用基因工程方法可以获得大量天然难以得到的生理活性物质： 人体内源性生理活性物质作为药物已有多年，例如胰岛素治疗糖尿病；人生长激素治疗侏儒症；甲状腺素治疗甲状腺功能不全等，但是这些物质不能由人组织提取，过去只能从动物脏器分离制备，这不仅造成来源困难，而且由于免疫抗原性的原故，在临床使用上也受到限制，而且提取过程中难免有病毒感染对病人造成严重后果。采用基因工程技术，可以在微生物或动物，哺乳动物细胞中表达并大量分离获得这些药物，为临床治疗提供了有效的保障。,(2)在获得大量有效生理活性物质基础上，可以使研究者对其进行深入结构、理化性质研究，在此基础上通过蛋白质工程等手段对其进行结构改造，降低毒副作用，从而获得更加理想的药物，并可进一步扩大其临床使用范围。(3)通过基因工程手段可以定向提高名贵药用植物、珍稀动物中有效药用物质含量，并可挽救濒危的药源。(4)由于采用微生物为表达宿主，因此可以规模化生产，成本低廉，降低环境污染，近年又发展了采用动物、植物为“生物反应器”，因此未来生产成本还会更加低廉。,(三) 新型疫苗： 新型疫苗主要指基因工程技术研制的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、以及遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗等。尽管新型疫苗种类很多，但根据其基本特征也可分为活疫苗和灭活疫苗两大类。其中载体疫苗为活疫苗，除核酸疫苗外均为灭活疫苗，核酸疫苗属一类特殊疫苗。采用基因工程方法克隆及表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体自身制成的疫苗称之为基因工程疫苗，是新一代疫苗的核心。需要指出的是一些常用疫苗经长期使用证明是安全有效的仍应使用，并非均要以基因工程疫苗代替，当前发展新疫苗的主要对象是：,a. 不能或难以培养的病原体：如HBV、HCV、HEV、疟 原虫、血吸虫等。b. 有潜在致癌或免疫药理作用的病原体：如HIV、1型嗜 人T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、单纯疱疹病毒(HSV)等， 后者如呼吸道合胞病毒(RSV)、登革热病毒(DGV)等。c. 常规疫苗效果差：如霍乱、痢疾、伤寒疫苗等。d. 有可能节约成本，简化免疫程序的多价疫苗。,目前基因工程乙型肝炎疫苗已在临床广泛使用，获得显著社会和经济效益。我国年产乙肝疫苗约2000万人份，产值2.5亿人民币，国内乙肝患者达1.2亿，基因工程乙肝疫苗市场预计可达数十亿人民币。 1999年，美国国立变态反应与传染病研究所提出“21世纪疫苗”。根据预期健康利益和节省卫生保健费用，对候选疫苗进行评价，分为四级。一级：巨细胞病毒疫苗，正常人群用流感病毒疫苗。二级：丙型肝炎病毒疫苗，单纯疱疹病毒疫苗，人乳头瘤病毒疫苗，呼吸道合胞病毒疫苗。三级：副流感病毒疫苗，轮状病毒疫苗。四级：EB病毒疫苗，艾滋病疫苗。,巨细胞病毒疫苗：新生儿感染可导致先天性耳聋和智力迟钝，重组CHO细胞表达的gB亚单位疫苗，小儿成人接种后有良好免疫原性。重组金丝雀痘病毒，活载体疫苗和DNA疫苗，动物实验证明能诱导体液和细胞免疫。 流感疫苗：为适应WHO推荐的流感毒株，进行基因重配。已接种观察1万多人，对儿童和成人均有效，HA和NA的亚单位疫苗已进行临床观察，基因重配的灭活疫苗在研发中。 艾滋病疫苗：重组活载体疫苗，蛋白或多肽亚单位疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗等均进行过临床观察，显示接种疫苗安全，能诱导体液和细胞免疫，但现有候选疫苗未能使受种者获有效保护。以活载体疫苗进行基础免疫，用亚单位疫苗作加强免疫的临床研究在进行中。,疫苗的发展方向：1.联合疫苗： 是指能预防多种疾病的联合制品，或能预防由同一病原体的不同株或不同血清型引起的同一疾病的多价疫苗。以百白破疫苗(DPT)为基础，结合乙型肝炎、流感、肺炎、伤寒等疫苗的研制是当前联合疫苗研究的热点。2.治疗性疫苗： 由大剂量高纯度微生物抗原和能提高免疫功能的其他成分组合而成为治疗性疫苗。抗原量大、免疫原性强、对免疫系统有较强刺激作用，疫苗通过不同途径将微生物抗原递呈给免疫系统，能更有效诱导免疫应答并消除免疫耐受。 目前已进行治疗麻风、利什曼病、慢性支气管炎、布氏杆菌病、泡疹病毒感,染、艾滋病及乙型肝炎等疾病的临床研究。 肿瘤疫苗是治疗性疫苗的研究热点之一，主要研究肿瘤的免疫原性、细胞因子激活机体免疫系统进行免疫治疗等。如将一种滤泡性淋巴肿瘤相关的独特IgG与钥孔槭血兰蛋白结合，以GM-CSF为佐剂，成功诱生了抗肿瘤应答，目前有数十种肿瘤疫苗进入了临床。3.通过食物摄取的疫苗和个性化疫苗： 如用HBsAg基因转染番茄，获世界首例候选植物来源的可食用乙型肝炎疫苗。目前食用疫苗尚存许多不稳定因素及技术问题有待进一步解决。,表 5 .国际上已注册的疫苗,以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体 工程药物是生物技术药物研究的热点之一，它包括单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体、抗体与“弹头”物质的偶联物和含抗体的融合蛋白。1.单克隆抗体： 特异性高、性质专一、适于大量生产，通过细胞工程可在体外定向制备各种单克隆抗体。单抗对相应抗原具高度特异性和抗原均质性，近二十年发展迅猛，单抗药物包括单抗和单抗偶联物。可用于治疗肿瘤、病毒感染、心血管疾病、脓毒症、类风湿性关节炎等，其中以肿瘤治疗居多。如前表所示美国19951999年间批准的24种生物药品中，有6种是单抗，在临床研究开发的品种中单抗种类最多， Rituxan是1997年第一个经FDA批准上市的抗肿瘤单抗药物，是以B细胞CD20分子为靶位的单抗，用于治疗B细胞性非霍奇金淋巴瘤，1999年销售额2.627亿美元，2000年上半年已达1.647亿美元。 1998年批准的,(四). 抗体工程药物：,Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的抗体，用于治疗HER-2/neu阳性乳腺癌。单抗药物对肿瘤选择性杀伤力强，存在的主要问题是单抗多数使用小鼠单抗制备，因此导致人抗鼠抗体反应(HAMA)，此外单抗药物在体内运送受多种因素影响，由于是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取。2.基因工程抗体： 要解决单克隆抗体免疫原性，需进行基因工程抗体研制，制备嵌合抗体以使鼠原性单抗人源化，或使用抗体片断如Fab，Fv，单链抗体scFv，diabody, mimibody 等，使抗体小型化从而降低抗原性。通过基因工程方法将特异抗体基因克隆至原核表达体系，构建并发展了抗体库技术，从而大大促进了新型基因工程抗体的制备和开发。随着人类基因组研究的完成，后基因组研究的开展将为疾病治疗提供新的分子靶位，为新型基因工程抗体研制提供广阔发展空间。,3.免疫偶联物和融合蛋白： 抗体与抗原的特异结合由其结构的可变区完成，而与抗原结合后激发的效应功能由结构的恒定区完成。为了提高抗体药物特别是治疗肿瘤抗体药物的疗效，提高对肿瘤的杀伤力，研究者采用效应分子(弹头)通过化学方法和抗体连接，制成免疫偶联物，利用抗体的特异性作为导向载体，通过“弹头”杀伤肿瘤细胞。用作“弹头”的物质主要有三类：放射性核素、化疗药物及毒素。这些物质与抗体连接后分别形成了放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。也可以通过基因工程方法获得融合蛋白，其中抗体部分多为scFv，弹头部分可为毒素片段、细胞因子或肽类药物。,值得注意的是，近年来治疗性抗体产品增长极快，年增长率达25-200。如治疗非霍奇金氏瘤的Rituxan年销售额近30亿美元。Humira上市仅2年，但销售额增长达200，2005年可达13亿美元。2004年2月批准上市的治疗晚期转移性结肠癌抗体Avastin 上市一年销售额已达6.76亿美元，随着该产品在非鳞非小细胞肺癌和乳腺癌治疗中的应用，预测其年销售额可达50亿美元。 据了解2002年美国有369种生物技术药物处于临床研究阶段，其中75种为抗体产品。2004年FDA批准7个新生物技术药物上市，治疗性抗体为4个预计至2008年还会有17种抗体陆续上市。到2005年1月为止，FDA共批准18种治疗性抗体，2种受体-Fc融合蛋白，6种体内诊断用单克隆抗体，治疗性抗体已成为应用最多的一类生物技术药物。值得指出的是市场普遍认可的治疗性抗体为人源(化)抗体，包括嵌合抗体(60-70%人源化)、人源化抗体(95%人源化)、人源抗体(100%人源化)，没有一个抗体片段用于治疗仅用于诊断。,表6. 2004年几种主要治疗性抗体销售额(百万美元),(五) 反义核酸药物： 反义技术是采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因的技术。根据碱基互补原理结合并调节靶基因活性的核酸分子称为反义核酸。作为一种基因下调作用因子，反义核酸主要包括反义脱氧核糖核酸(ODN)、反义RNA、核酶(ribozyme)和三链形成寡核苷酸(TFO)等，在抑制一些有害基因表达和失控基因过度表达方面起了重要作用。反义核酸药物主要有以下特点：1.高度特异性： 反义核酸药物通过特异碱基互补配对作用于靶DNA或RNA，可区分基因结构的微小差异。,2.高效性： 可直接阻止靶基因的转录和翻译。3. 最优化的药物设计： 可针对靶基因序列进行简单理性化设计，是应用基因序列信息的最合理药物设计途径之一。4. 低毒安全： 在体内最终均被降解清除因此毒性低，避免了如转基因疗法中外源基因整合至宿主染色体的危险性。5.合成反义核酸相对较易。 目前第一个反义寡核苷酸药物福米苇新已在美国和欧州上市，用于治疗对其它治疗方案不能耐受、或禁忌或对巨细胞毒性视网膜炎治疗方法无效的艾滋病患者巨细胞病毒视网膜炎。,表 7. 临床试验中的反义寡核苷酸,(六)RNA干扰剂 内源或外源的双链RNA导入细胞后，介导序列特异的转录后基因沉默，从而抑制靶基因的表达称为RNA干扰(RNAi)。 对靶基因mRNA有特异降解作用的小干扰RNA(siRNA)定义为RNA干扰剂。A.RNAi特点：1.RNAi是转录后水平的基因沉默2.具有很高特异性：特异降解与之序列对应的单个内源基因 mRNA。3. RNAi抑制基因具高效性：极少量dsRNA能完全抑制相应基因 表达。4. RNAi具一定传递效应。B. siRNA和反义药物区别：siRNA是双链结构，反义药物为单链。2. siRNA必须在相关协同因子和核酸酶、RNA依赖性RNA聚合酶、解旋酶、激酶等存在下才能介导降解靶 mRNA。,3. siRNA自身无催化作用。4. siRNA在细胞相对稳定。5. siRNA介导的RNAi效应有遗传性(晡乳动物细胞尚未发现)。6. siRNA能特异识别具单一点突变的靶RNA序列。 和单链反义寡核苷酸、核酶及脱氧核酶比较，siRNA具高特异和高效性，抑制基因表达更为理想。C. RNA干扰的应用：1.用于研究基因功能。2.用于基因敲除。3.进行基因表达调控研究。4. 抗病毒和抗肿瘤：已有深入研究。用于进行肿瘤基因治疗。,(六). 基因治疗： 基因治疗简而言之是用基因治疗疾病，以往主要针对遗传性单基因缺陷型疾病。1990年美国国立卫生研究院(NIH)的Blase和Anderson采用ADA(腺苷酸脱氨酶)基因治愈了一个由于ADA基因缺陷导致的严重免疫缺损4岁女孩，从而在世界范围使基因治疗受到关注。近年来，已从单基因遗传病扩大到多基因疾病，如肿瘤，心脑血管疾病，神经系统疾病、自身免疫疾病、艾滋病及内分泌疾病等。方法分为性细胞基因治疗和体细胞基因治疗，目前临床试验的均为体细胞治疗，至1996年底已有1537例患者接受这一疗法，表明体细胞基因治疗具有较好操作性，但其缺点在于并没有改变病人已有单个或多个基因缺陷的遗传背景，以致后代必然会发生该病的遗传。性细胞基因治疗是在患者的性细胞中进行操作，使后代不会再遗传这种疾病，目前技术难点在于基因定点整合(基因打靶)，且志愿接受治疗者少，因此未进入临床研究。,外源基因只有整合至染色体中，成为其一部份才能获持续高效表达，因此，要选择合适载体，使外源基因进入胞核与染色体整合，目前主要采用腺病毒(AV)及腺相关病毒(AVV)等作为载体。当前大部分基因治疗均是从病人体内获得某种细胞(如T淋巴细胞)，体外培养并进行基因转移，再重新输入患者体内，这称之为体外(in vitro)基因治疗，