单纯疱疹病毒1型药物敏感性测定方法的建立.doc

单纯疱疹病毒1型药物敏感性测定方法的建立 344单纯疱疹病毒1型药物敏感性测定方法的建立刘军连徐志凯喻启桂单纯疱疹病毒(HSV)分HSV一1和HSV一2两个血清型，其中HSV一1可引起角膜炎、口唇疱疹等多种疾病，由HSV一1引起的生殖器疱疹的发病率也逐年上升。 以阿昔洛韦(ACV)为代表的核苷类抗病毒药物问世以来，HSV引起的疾病已得到了有效的治疗。 随着ACV的广泛应用，HSV出现耐药，且有逐渐增加的趋势，成为临床必须面对的一个问题。 为研究HSV一1的耐药性，我们采用空斑抑制试验测定HSV一1对ACV的敏感性，并在体外建立了ACV耐药病毒株。 1材料与方法11细胞及培养乳兔肾细胞(BHK21株)由第四军医大学微生物学教研室提供。 BHK21培养按常规进行，在CO，孵育箱中37。 【=培养，取02mL细胞悬液(10106个mL)入至24孔板中，经24h培养成细胞单层，备用。 12病毒株HSV一1标准株SM44毒株引自北京生物制品研究所，在BHK21细胞中传代，微板法测定培养上清中病毒滴度为106TCID5001mL，一80C保存。 13主要试剂ACV购自红惠医药有限公司。 胎牛血清和RPMI1640培养基分别为杭州四季青生物工程材料有限公司和GIBCO公司产品。 14测定HSV一1对ACV的敏感性采用空斑抑制试验方法，具体为取01mL HSV一1培养上清加入BHK21细胞单层中，37C吸附1h后弃去病毒，加入含1胎牛血清的RPMI1640维持液和1甲基纤维素的等量混合液，并加入不同浓度的ACV(ACV浓度分别为 0、0 2、0 4、0 8、1 6、32及64tgmL)，在C0，孵育箱中37C培养。 观察72h后，10甲醛固定10r ain，1结晶紫染色30min，用清水漂洗、晾干，参照Nitta等的方法清点空斑数，计算空斑抑制率。 空斑抑制率=(对照组平均空斑数一实验组平均空斑数)对照组平均空斑数X100。 以药物浓度为横坐标，空斑抑制率为纵坐标做出曲线图，由此得出药物的半数抑制浓度(IC50)。 每个药物浓度重复测定3次。 15耐ACV HSV一1毒株的建立在感染HSV一1基金项目首都医学发展科研基金(xx3090)1解放军第306医院皮肤科，北京，1001012第四军医大学微生物学教研室，西安，710032Chin JLepr SkinDisMayxxVo127No5技术与方法SM44毒株的BHK21细胞中加人ACV2mL，培养72h，反复冷冻一复苏以破坏细胞，释放出病毒，离心后取含有病毒的上清液，再接种于BHK21细胞，加入ACV2tgmL培养。 连续培养9代，分别在第 3、6和9代测定病毒对ACV的敏感性。 t6统计学方法用Excelxx建立数据库，SPSS130统计软件进行统计分析。 2结果21HSV一1对ACV的敏感性HSV一1在不同浓度ACV中的平均空斑数和空斑抑制率见表1。 通过作图计算，得出HSV一1对ACV的IC50为07”gmL。 22耐ACV HSV一1毒株的建立HSV一1SM44毒株在含有ACV的环境中培养 3、6和9代后，测得对ACV的IC50分别为72tgmL、342tgmL和853tgmL。 国外研究以IC5020tgmL即为病毒对ACV耐药，故本实验中HSV一1在连续培养3代后即产生了耐药性。 表1不同浓度ACV对HSV一1空斑形成的影响3讨论以ACV为代表的核苷类抗病毒药物的临床应用是病毒治疗史上的一次创举，ACV已在临床上应用20余年，其疗效和安全性已被肯定。 自1982年报道了第1例临床对ACV耐药的HSV感染以来，国外这类报道逐渐增多。 以往认为在HSV感染而免疫功能正常的人群中，对ACV耐药的出现率不超过1，但近期报道耐ACV的病毒检出率高达8605在免疫功能低下的人群中，病毒耐药的出现率明显增高，Morf in等报道，接受同种异体骨髓移植的患者一旦发生HSV感染，则有30为耐药病毒株所致。 随着艾滋病和器官移植患者的增多，以及糖皮质激素的广泛应用，病毒耐药性有逐渐增加的趋势，成为临床必须面对的一个问题。 中国麻风皮肤病杂志xx年5月第27卷第5期目前主要通过临床观察来判断抗病毒药物的疗效，很难及时发现病毒耐药性的产生，导致病程迁延和药物毒副作用的产生o3,5因此，对HSV耐药性的定性和定量检测及监测十分必要。 近年来，国外学者采用空斑抑制试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应、流式细胞分析等方法测定病毒对药物的敏感性，其中空斑抑制试验应用最广泛，被称为“金标准(gold standaM)”o4,7我们采用空斑抑制试验测定HSV一1的IC50来判断病毒的药物敏感性，结果证明空斑抑制试验方法实用、可靠，操作简单易掌握，对仪器设备的要求不高，适合临床应用。 在应用空斑抑制试验监测HSV一1耐药性时，国外多以IC5020gmL作为对ACV的耐药标准。 本实验中测得HSV一1标准株SM44毒株对ACV的IC50为07btgmL，在药物敏感性实验中可以作为ACV的敏感株。 而在含有ACV的环境中培养 3、6和9代后对ACV的IC50分别为72gmL、342tgmL和853ygmL，其IC50均超过20tgmL，故认为本实验中HSV一1SM44毒株在连续培养3代后即产生了耐药性，可以作为ACV的耐药病毒株。 本实验建立的空斑抑制试验可用于体外检测各种药物对HSV一1的作用效果，筛选有效的药物治疗方案。 345参考文献1Gupta R，Warren T，Wald AGenital herpesLancetxx；370 (9605)212721372Crumpacker CS，Sehnipper LE，Marlowe SI，et a1Resistance toa ntiviral drugsof herpessimplex virusisolated froma patienttreated wi山acyclovirN EnglJ Med1982；306 (6)3433463Ziyaeya nM，Alb omiA，Japoni A，et a1Frequency ofacyclovirresistant herpessimplex viruses isolatedfrom thegenera limmunopetent populationand patients withacq uired immunodefieiency syndromeInt JDermatolxx；46 (12)126312664Nitta K，Shiota H，Nito T，et a1Sensitivities ofother antiviral drugsa ndt hymidinekinase activity ofaciclovirresista nt herpessimplex virus type1J JpnOpht halmolSoc1994；98 (6)5135195Stranska R，Schuurman R，Nienhuis E，et a1Survey ofacyclovirresista nt herpessimplex virus int heNet herlandsprevalence andcharacterizationJ ClinVimlxx；32 (1)7186Morf inF，Bilger K，Boucher A，et a1HSV excretionafter bonemarrowanspla ntafiona4一year surveyJ ClinVirolxx；30 (4)3413457Weinberg A，Leary JJ，Sarisky RT，et a1Factors thataf fectin vitromeasurement ofthe susceptibilityof herpessimplex virus tonucleoside analoguesJ ClinVirolxx；38 (2)139145(收稿xx1216)xx全国护肤品研发应用暨皮肤无创性测量技术讲习班中国皮肤科医师协会皮肤美容培训基地四川大学华西医院主办的国家继续医学教育I类项目“全国护肤品研发应用暨皮肤无创性测量技术讲习班”由全国皮肤美容和化妆品学界的专家授课，将化妆品研发制备和皮肤科学的前缘技术结合起来。 通过讲授和实习，熟悉外用药物和化妆品常见剂型的配制，掌握皮肤屏障、颜色、皮脂、皱纹、皮肤微循环等测量方法和仪器使用；了解国内外化妆品新原料、新配方、中药护肤品研发进展，提高护肤品、外用药的研发、评价和临床应用能力。 欢迎皮肤科医师、美容师、化妆品研发、评价、销售或日用化工技术人员踊跃报名参加。 培训、讲义费、实验材料及仪器耗损费等1500元人，食宿交通费自理。 时间xx年7月1420日在成都举行。 报到地点成都公行道1号(华西医院第五住院大楼院内右侧)科研楼第3层乘车路线成都火车北站下车，乘地铁1号线华西坝站；公交车16路华西坝站或2