DNA重组技术的基本工具讲课.ppt

焦作一中任晓东 DNA重组技术的基本工具 基因工程需要哪些特殊工具 分子手术刀 限制性核酸内切酶 分子运输车 载体 分子缝合针 DNA连接酶 EcoR 黏性末端 黏性末端 EcoR 黏性末端 黏性末端 将两个相同的黏性末端之间连接起来 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 E coliDNA连接酶 有一或多个限制酶切点 有一个或多个标记基因 便于筛选 导入基因能在受体细胞中复制 表达 对受体细胞无害 载体的特点 在实际操作过程中 载体的这些特点能否满足实际需求 EcoRI酶切后的载体和目的基因 目的基因 载体 多个EcoRI酶切后的载体与目的基因混合之后 加入DNA连接酶 其连接产物是否只有一种 载体与目的基因之间的连接 载体与载体之间的连接 目的基因与目的基因之间的连接 载体自身头尾相连接 自身环化 目的基因自身环化 载体自身环化和目的基因自身环化是干扰重组的常见因素 为什么EcoRI酶切后会有这么多种连接产物呢 结论 一种限制酶切割后产生的黏性末端只有一种 相同的黏性末端之间可以任意连接 基因工程需要的是目的基因与载体连接而成的重组DNA 观察对比 小组之间观察并比较制作的该重组DNA是否有不同 同向插入 反向插入 目的基因插入方向不同将导致出现不同的基因产物 如何解决目的基因定向插入的问题呢 提示 载体的特点之一 有多个不同的酶切位点 材料 两种限制酶切割产生的黏性末端不同 载体与载体间 目的基因与目的基因间仍可连接 载体及目的基因无法自身环化 正确连接 无法连接 一 载体含有多个酶切位点 二 双酶切 1 保证目的基因的定向插入 2 提高DNA的重组率 拓展提高 筛选含目的基因的重组DNA 载体特点中除有多个酶切位点外 还携带标记基因 如何筛选出含目的基因的重组DNA呢 载体与载体重组DNA 载体与目的基因重组DNA 提示 在基因工程的实际操作中 科学家选择的载体往往含有两个或更多的标记基因 如果在目的基因的插入位置有一个标记基因 当目的基因插入后 标记基因将被破坏而无法表达 从而达到筛选目的 目的基因 1 DNA重组所需三种基本工具2 载体特点 a 多酶切位点b 多标记基因 反馈练习 巩固提高 下列有关基因工程的叙述中 错误的是 A DNA连接酶将黏性末端的碱基连接起来B 限制性内切酶用于目的基因的获得C 目的基因需有载体导入受体细胞D 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 反馈练习 巩固提高 与 限制酶 作用部位完全相同的酶是 A 反转录酶B RNA聚合酶C DNA连接酶D 解旋酶 C 反馈练习 巩固提高 质粒是基因工程中最常用的运载体 它存在于许多细菌体内 质粒上有标记基因如图所示 通过标记基因可以推知外源基因 目的基因 是否转移成功 外源基因插入的位置不同 细菌在培养基上的生长情况也不同 下表是外源基因插入位置 插入点有a b c 请根据表中提供细菌的生长情况 推测 三种重组后细菌的外源基因插入点 正确的一组是 A 是c 是b 是aB 是a和b 是a 是bC 是a和b 是b 是aD 是c 是a 是b A 反馈练习 巩固提高 下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点 如图 已知某DNA在目的基因的两端1 2 3 4四处有BamH 或EcoR 或Pst 的酶切位点 现用BamH 和EcoR 两种酶同时切割该DNA片段 假设所用的酶均可将识别位点完全切开 下列各种酶切位点情况中 可以防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的是 A 1为BamH 2为EcoR 3为BamH 4为Pst B 1为EcoR 2