DNA的粗提取与鉴定(优秀课件).ppt

DNA的粗提取与鉴定 实验思路 DNA的提取和鉴定 DNA从哪儿提取 怎样将DNA与细胞中的其他物质分离 怎样鉴定我们提取的DNA 内容解析 基础知识 DNA的物理化学性质 如何利用DNA的物理化学性质提取和鉴定DNA 思考 1 洗涤剂能溶解细胞膜 但不会破坏DNA 将DNA从细胞中提取出来 2 当氯化钠的物质的量浓度为2mol L时 DNA的溶解度最大 浓度为0 14mol L时 DNA的溶解度最低 可以使DNA在盐溶液中溶解或析出 3 DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精 可以将DNA与蛋白质进一步分离 4 DNA与二苯胺在沸水浴条件下呈蓝色 鉴定DNA 提取DNA的实验步骤 破碎细胞 获取含DNA的滤液 选取实验材料 去除滤液中的杂质 析出DNA 鉴定DNA 二 DNA的粗提取与鉴定的实验设计 一 实验材料的选取 材料 鱼卵 猪肝 菜花 香蕉 鸡血 哺乳动物的红细胞 猕猴桃 洋葱 豌豆 菠菜 在液体培养基中培养的大肠杆菌 从中选取2 3种实验材料 原则 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 但选用DNA含量相对较高的生物组织 成功的可能性更大 无细胞壁 将其加入蒸馏水中 使其破裂释放DNA 有细胞壁 需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜 进行充分的搅拌和研磨 才能使其破裂释放DNA 二 破碎细胞 获取含DNA的滤液 动物细胞 植物细胞 讨论 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么 答 洗涤剂是一些离子去污剂 能溶解细胞膜 有利于DNA的释放 食盐的主要成分是NaCl 有利于DNA的溶解 实例 提取洋葱DNA时 在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐 进行充分的搅拌和研磨 过滤后收集研磨液 答 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全 提取的DNA量变少 影响实验结果 导致看不到丝状沉淀物 用二苯胺鉴定不显示蓝色等 讨论 如果研磨不充分 会对实验结果产生怎样的影响 三 去除滤液中的杂质 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分 答 可能含有核蛋白 多糖和RNA等杂质 讨论 为什么反复地溶解与析出DNA 能够去除杂质 答 用高盐浓度的溶液溶解DNA 能除去在高盐中不能溶解的杂质 用低盐浓度使DNA析出 能除去溶解在低盐溶液中的杂质 因此 通过反复溶解与析出DNA 就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 讨论 方案二与方案三的原理有什么不同 答 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白 从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同 从而使蛋白质变性 与DNA分离 四 DNA的析出与鉴定 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液 体积分数为95 静置2 3min 溶液中会出现白色丝状物 这就是粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌 卷起丝状物 并用滤纸吸取上面的水 1 DNA的析出 2 DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol L的NaCl溶液5ml于两只试管中 其中一只加入DNA丝状物 各加入二苯胺4ml试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热5min 待试管冷却后 比较两只试管中溶液颜色的变化 看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色 一 案例一 以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取 三 实验案例 鸡血细胞极易吸水胀破 而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心 对设备要求较高 操作繁琐 历时较长 1 鸡血细胞做实验材料的原因 鸡血细胞核的DNA含量丰富 材料易得 2 实验原理 DNA在NaCl溶液中的溶解度 是随着NaCl的浓度的变化而改变的 当NaCl的物质的量浓度为0 14mol L时 DNA的溶解度最低 利用这一原理 可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出 DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液 利用这一原理 可以进一步提取出含杂质较少的DNA DNA遇二苯胺 沸水浴 会染成蓝色 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 3 实验材料和用具 鸡血细胞液 5 10ml 体积分数为95 的冷酒精溶液 实验前置于冰箱内冷却24h 蒸馏水 质量浓度为0 g ml的柠檬酸纳溶液 务质量的浓度分别为2mol L和0 015mol L的氯化纳溶液 二苯胺试剂 铁架台 铁环 镊子 三角架 酒精灯 石棉网 载玻片 玻璃棒 滤纸 滴管 量筒 100ml 一个 烧杯 100ml 一个 50ml 500ml各二个 试管 20ml 二个 漏斗 试管夹 纱布 4 课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0 1g ml的柠檬酸纳溶液 抗凝剂 100ml 置于500ml烧杯中 注入新鲜的鸡血 约180ml 同时用玻璃棒搅拌 使血液与柠檬酸纳溶液充分混合 以免凝血 将烧杯中的血液置于冰箱内 静置一天 使血细胞自行沉淀 也可以将血液倒入离心管内 用1000r min 转每分 的离心机离心2min 血细胞沉淀于离心管底部 实验时 用吸管除去离心管上部的澄清液 就可以得到鸡血细胞液 过程 柠檬酸钠作用 防止血液凝固 作用机理 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2 发生反应 生成柠檬酸钙络合物 血浆中游离的Ca2 大大减少 血液就不会凝固 讨论 提取鸡血中的DNA时 为什么除去血液中的上清液 答 血液分为两部分 一部分是血浆 一部分是血细胞 离心后除去的上清液是血浆 5 方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5mL 10mL 注入到50mL烧杯中 向烧杯中加入蒸馏水20mL 同时用玻璃棒充分搅拌5min 使血细胞加速破裂 然后 用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL 取其滤液 提取鸡血细胞的细胞核物质 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA 容易被玻璃容器吸附 所以在提取过程中为了减少DNA的损失 最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 注意事项 讨论 答 让细胞内浓度大于周围溶液的浓度 细胞会吸水以至胀破 1 为什么要加入蒸馏水 加入蒸馏水后细胞会有什么变化 2 用玻璃棒搅拌有什么意义 答 用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂 注意应沿一个方向快速搅拌 但也不能太快太猛 防止打碎DNA 3 滤去的是什么物质 得到的是什么 答 过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA 溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为2mol L的溶40mL加入到滤液中 并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min 使其混合均匀 这时DNA在溶液中呈溶解状态 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水 同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌 这时烧杯中有丝状物出现 注意观察丝状物呈什么颜色 继续加入蒸馏水 溶液中出现的粘稠物会越来越多 当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水 这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0 14mol L 析出含DNA的粘稠物 讨论 加入蒸馏水的目的 降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点 使DNA从NaCl溶液中析出 将溶液中的DNA与其他杂质分离 这一步骤是实验成败的关键 实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水 并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌 以利于DNA分子的附着和缠绕 注意事项 滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗 过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中 含DNA的粘稠物被留在纱布上 将DNA的粘稠物再溶解 取1个50mL烧杯 向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol L的溶液20mL 用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中 用玻璃择不停地搅拌 使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中 过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100mL烧杯 用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液 取其滤液 DNA溶于滤液中 提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中 加入冷却的 酒精的体积分数为95 的溶液50mL 使用冷却的酒精 对DNA的凝集效果较佳 并用玻璃棒搅拌 溶液中会出现含杂质较少的丝状物 用玻璃棒将丝状物卷起 并用滤纸吸取上面的水分 这种丝状物的主要成分就是DNA 答 因为DNA不溶于冷酒精 而其他物质可以溶解在酒精中 使含杂质较少的DNA丝状物可以析出 悬浮于溶液中 讨论 2 观察丝状物呈什么颜色 答 白色 1 为什么要加50mL的冷酒精 取两支20mL的试管 各加入氯化钠的物质的量浓度为0 015mol L的溶液5mL 将丝状物放入其中一支试管中 用玻璃棒搅拌 使丝状物溶解 然后 向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热5min 待试管冷却后 观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 DNA的鉴定 讨论 答 有丝状物的试管变成蓝色 另一试管还是原来颜色 2 这一鉴定结果说明什么问题 1 比较两个试管中溶液的颜色有什么不同 答 提取出的丝状物是DNA 3 DNA的直径约为20 10 10m 实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小 答 DNA分子直径只有2nm 丝状物是多个DNA子聚在一起形成的 答 整个实验共 第1次 步骤1 细胞吸水胀破第2次 步骤3 使DNA黏稠物析出 此实验过程中有几次使用蒸馏水 几次过滤 几次析出 几次搅拌 分别在哪一步 实验总结 两次蒸馏水 三次过滤 两次析出 六次搅拌 两次蒸馏水 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关 第二次要用其滤出的黏稠物有关 所以要使用多层纱布 第一次和第三次均要用其滤液 使用的纱布为1 2层 三次过滤 第1次 步骤1 DNA存在于滤液里第2次 步骤4 DNA被留在纱布上第3次 步骤6 DNA存在于滤液里 两次析出 第1次 步骤3 用0 14mol L的NaCI溶液 含杂质多 第2次 步骤7 用冷却的95 的酒精 六次搅拌 其中除第8步外 其余均要朝一个方向搅拌 在第三 五步搅动还要轻缓 玻璃棒不要直插烧杯底部 这样才能保证得到完整的DNA 第1 2 3 5 7步 1 在DNA的粗提取实验过程中 两次向烧杯中加蒸馏水的作用是 A 稀释血液 冲洗样品B 使血细胞破裂 降低NaCl浓度使DNA析出C 使血细胞破裂 增大DNA溶解量D 使血细胞破裂 提取含杂质较少的DNA A 随着NaCl溶液浓度的增大 DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大B 随着NaCl溶液浓度的减小 DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小C DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关D 当NaCl溶液的浓度为0 14M时 DNA的溶解度最低 2 关于DNA在NaCl溶液中的溶解度 下面的叙述哪一个是正确的 3 2006 江苏做DNA粗提取和鉴定实验时 实验材料用鸡血而不用猪血的原因是 A 鸡血的价格比猪血的