乳腺癌基因治疗的研究进展.ppt

乳腺癌基因治疗研究进展Theresearchprogressofhumanbreastcancergenetherapy 曾赵军中南大学生物科学与技术学院分子生物学系 2 乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤 据国际抗癌协会 IARC 公布的统计资料表明 乳腺癌在全世界大多数地区的发病率有逐年增高的趋势 现已成为女性发病率最高的恶性肿瘤 第一节乳腺癌基因治疗研究背景 3 乳腺癌的危险因素 1 与发育 激素水平有关 2 与营养膳食有关 3 与家族史和基因改变遗传因素有关a 抑癌基因失活b 癌基因异常 4 其它危险因素 4 乳腺癌肿瘤治疗模式 手术 放疗 化疗 激素治疗是肿瘤治疗的常规模式 这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤细胞又易伤及正常组织 特别是伤害机体的免疫系统 目前肿瘤的基因治疗日益受到人们的重视 显示出良好的应用前景 5 乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面 第一 基因表达异常 最常见的基因表达异常是cyclinD1 neu和ras c myc或Wnt 1原癌基因过表达 第二 基因结构改变 包括染色体缺失与基因扩增 第二节乳腺癌自杀基因治疗的概念 内容与特点 6 Breastcancergenetherapyusingtumoursuppressorgenes Clinicaltrialsofp53genereplacementhavehadlimitedsuccess PTENexpressionaltersmetastaticpotentialandreducesneovascularization 7 Prospects TheabilitytoinducegrowtharrestandapoptosisDownstreamtargetsofp53andRbisnecessaryClinicaltrialsofsecond generationoncolyticvirusesCombinationsoftumoursuppressorgenes 8 乳腺癌抗体治疗 单克隆抗体Herceptin 贺赛汀 针对HER 2 neu原癌基因的人 鼠嵌合单抗 与细胞表面的erb B2受体结合 抑制乳腺癌细胞的生长 产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 免疫基因治疗 指在基因水平 通过诱发或加强机体内针对肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原 TAAs 的特异性免疫反应 调动宿主的免疫系统来识别并破坏癌细胞 乳腺癌组织表达多种TAAs 包括HER 2 neu c er 2 MACG 1和MUC 1等 机体针对这些TAAs产生一定的特异性体液和细胞免疫反应 将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内 或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内 在肿瘤细胞经放射线照射灭活后 自身移植于体内 以增强免疫反应 包括IL 2 IL 12 干扰素 粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 GM CSF 等 10 采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效 目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER 2 CEA MAGE 1 MUC 1等 采用基因工程将编码这些抗原的基因修饰后 克隆到逆病毒载体 转入体内 或在体外采用基因工程 将这些抗原的不同抗原簇克隆 产生不同抗体 筛选出能抑制肿瘤细胞生长的抗体 赫赛汀 Herceptin 就是针对c er 2细胞外区域不同抗原簇的人单克隆抗体 它可有效抑制c er 2的下游信号传导 从而抑制乳腺癌细胞的生长 特异性靶抗原的免疫治疗 肿瘤抑癌基因治疗 野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞瘤基因控制细胞凋亡 抑制细胞增殖的作用 但是 由于乳腺癌细胞中p53易突变而失活 影响了p53基因治疗乳腺癌应用 在乳腺癌家族中发现抑癌基因BRCA1常存在突变而表达过低 在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体 直接注射入瘤内 可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的生长 化学基因治疗 将耐药基因 如多药耐药基因 MDR 转入造血干细胞 然后自体回输以增加化疗药物剂量 增强疗效 也不影响机体的造血系统 Cowan等将4例乳腺癌病人的造血细胞提取后 体外转染MDR基因 并且在体外应用大剂量化学药物杀死可能污染的肿瘤细胞后 将转染了MDR的造血细胞自身移植 给予大剂量的化学药物治疗后 3例病人移植细胞中仍可检测到MDR的表达 转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反比 无严重毒副作用发生 药物前体激活基因治疗 GPAT 可以利用正常和肿瘤细胞之间的某一基因转录差异 选择性驱动表达导入肿瘤细胞内的无活性化疗药物前体转化为有活性的代谢产物 特异性杀伤肿瘤细胞 氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用 但5 氟胞嘧啶核苷酸 5 FC 作为药物前体 对细胞无杀伤作用 而它在嘧啶脱氨酶的转化下 可代谢为有活性的5 FU 5 氟尿嘧啶 而具有杀伤肿瘤细胞的能力 化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合物 维生素B17可以通过竞争性结合ATP 不可逆地抑制c er 2活性 而不影响其蛋白表达 动物实验表明 维生素B17可使c er 2过度表达的乳腺癌肿瘤缩小 显性基因敲除治疗 敲除显性的癌基因 削弱肿瘤的生长和浸润能力 研究表明 一种myc反义核酸对雌激素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞均有抑制作用 转化生长因子 TNF 的反义信使RNA能够抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳腺癌细胞的增殖 抗血管生成基因治疗 抗血管生成基因的因子包括内皮抑素 血管抑素和干扰素 基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因表达的差异 选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基因的表达 抑制肿瘤血管生成 从而达到治疗肿瘤的目的 最强的血管生成细胞因子是VEGF 反义核酸 可溶性VEGFR 核糖酶 抗VECF单克隆抗体和受体酪氨酸激酶 RTK 抑制剂已被用于抗肿瘤血管生成的基因治疗 18 自杀基因治疗乳腺癌的作用机理 病毒载体 病毒蛋白 自杀基因 药物前体 毒性代谢物 乳腺癌细胞 直接杀伤癌细胞 通过旁观者效应杀伤癌细胞 19 自杀基因HSVtk编码胸腺嘧啶激酶 在细胞内 自杀基因HSVtk能将核苷类似物GCV磷酸化 使其进一步代谢为三磷酸GCV 抑制细胞DNA聚合酶 影响DNA合成 导致细胞死亡 达到清除肿瘤的目的 20 存在的问题 目的基因的表达不受控制 存在过度表达或不适当表达 特别是当插入基因是一些毒性的基因或对机体有影响时 不仅对疾病的治疗不利 甚至会导致致命的副作用 21 特异性的转录调控元件使治疗基因准确 有效地表达于肿瘤细胞 使治疗基因的表达受体外因素的调控 提高基因治疗的有效性和可控性 是基因治疗领域的一个重要问题 第三节乳腺癌自杀基因调控治疗 22 乳腺癌基因治疗的调控元件 1 乳腺癌相关基因 erbB 2 Muc 1 p53 BRCA1 BRCA2 nm23 p16等 2 组织特异性基因 雌激素反应元件 ERE 人 乳白蛋白基因 hALA 羊乳球蛋白基因 oBLG 等 3 缺氧反应元件 HRE 等 23 Tet基因表达调控系统 Tet系统利用大肠杆菌抗四环素操纵子的阻遏与去阻遏作用来调控基因表达 使基因表达受四环素的精确调控 Tet激活系统 Tet On 是突变的tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达rtTA 强力霉素存在时 rtTA与tetOp结合 激活靶向转录 24 Tet On调节乳腺癌细胞株HSVtk表达及体外调控性治疗作用的实验研究 25 重组逆转录病毒载体pRevTRE tk的构建 PCR扩增获得HSVtk基因DNA片段 设计引物时 在引物TK1的5 加上BamH 酶切位点 引物TK2的5 加上Hind 酶切位点 定向克隆到pRevTRE质粒上 得到pRevTRE tk质粒 26 重组逆转录病毒载体pRevTRE tk的鉴定 M12 图1重组质粒pRevTRE tk的酶切鉴定结果M DNA Hind DNAMarkerlane1 pRevTRE HSVtk BamHI Hind lane2 pRevTRE HSVtkplasmidDNA 图2重组质粒pRevTRE tk的PCR鉴定结果M 100bpDNAladderMarker lane1 PCRproductwithprimerTK1andTK2 lane2 PCRproductwithprimerTK3andTK4 27 MCF 7细胞转染实验 MCF TRE tk Tet On 28 Tet On基因调控系统中 其发挥作用所需的两个组成元件 TRE元件和rtTA元件 分别克隆于两个载体系统中 使用时先将含有TRE元件和目的基因转染入宿主细胞 然后再以含有rtTA的质粒转染该细胞 经过两次转染而构建出细胞株 29 MCF TRE tk Tet On细胞HSVtk基因的表达 图3Dox调节MCF TRE tk Tet On细胞中HSVtk基因的表达M 100bpDNAMarker Lane1 6代表Dox浓度为0 0 1 1 10 100 1000 g ml时细胞HSVtk基因的表达 30 MTT法检测分析MCF TRE tk Tet On细胞存活率 图4在Dox浓度为1 g ml时 MTT法检测GCV不同浓度时MCF TRE tk Tet On细胞存活率的变化 31 Dox浓度对MCF TRE tk Tet On细胞生长的影响 图5GCV浓度为1 g ml时 不同浓度Dox对MCF TRE tk Tet On细胞存活数的影响 32 旁观者效应 表1MCF TRE tk Tet On细胞旁观者效应的克隆记数 33 可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立 以表达HSVtk基因及调控系统Tet On的乳腺癌细胞MCF TRE tk Tet On直接接种SCID小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳腺癌动物模型 为探讨自杀基因体外调控机制的研究奠定了基础 34 SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化 图6乳腺癌细胞MCF TRE tk Tet On接种SCID小鼠后 NS组 GCV组 GCV Dox组SCID小鼠肿瘤体积的变化 35 SCID小鼠肿瘤组织病理学观察 图7三组 NS组 GCV组 GCV Dox组 SCID乳腺癌小鼠经治疗15天后肿瘤组织病理学观察H E染色 250 NS对照组 GCV治疗组 Dox GCV治疗组 36 RT PCR检测SCID小鼠肿瘤组织HSVtk的表达 M123 图8RT PCR检测各组SCID小鼠肿瘤治疗15天后HSVtk的表达M 100bpMarker 1 GCV治疗组 2 Dox GCV治疗组 3 NS对照组 37 研究背景 逆转录病毒载体用于exvivo基因治疗 实际感染效率低 原因 一 感染正在分裂的细胞 二 获得病毒滴度低 三 病毒半衰期短 移动距离有限 在一个半衰期内大多数病毒不能到达靶细胞 重组逆转录病毒介导的HSVtk基因表达及提高逆病毒滴度的初步研究 38 逆转录病毒的纯化 将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥去除更多的水分 以小体积的缓冲液 DMEM 复溶后 70 冻存得到浓缩病毒液 39 产毒PA317阳性细胞克隆筛选培养 图14微乒乓感染pRevTRE HSVtk pRevTet On pRevTRE载体的PA317细胞经潮霉素B G418筛选2周后形成的抗性克隆 100 40 不同培养时间与重组病毒滴度的关系 图9不同培养时间对克隆PA317细胞产生重组病毒滴度的测定 41 不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系 05101520 图10不同丁酸钠浓度下对克隆PA317细胞培养30h产生重组病毒滴度的测定 42 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达 图11克隆PA317细胞上清SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳M 蛋白质分子标准 Lane1 pRevTREDNA转染PA31730h后细胞上清 Lane2 pRevTRE tkDNA转染PA31730h后细胞上清 43 PCR检测克隆的细胞上清有无HSVtk基因插入片段 图12转染PA317细胞上清PCR扩增HSVtk基因M 100bpDNA标准物 Lane1 pRevTRE tkDNA转染PA31730h后细胞上清 Lane2 pRevTREDNA转染PA31730h后细胞上清 44 RT PCR检测被逆转录病毒浓缩液感染的MCF 7细胞中HSVtk基因的表达 actin420bp 图13逆转录病毒浓缩液感染的MCF 7细胞中HSVtk基因的表达M 100bpDNA标准物 Lane1 MCF 7细胞 Lane2 被重组逆转录病毒液感染的MCF 7细胞 45 产毒性细胞系分泌重组病毒的PCR鉴定 图15pRevTRE tk pRevTet On pRevTRE乒乓转染的PA317细胞上清PCR扩增目的基因M 100bpladdermarker 1 转染pRevTRE HSVtk质粒载体的克隆PA317细胞上清 2 转染pRevTet On质粒载体的克隆PA317细胞上清 3 转染pRevTRE质粒载体的克PA317细胞上清 46 重组病毒感染MCF 7细胞及阳性克隆细胞株的筛选 图16重组病毒感染MCF 7细胞后筛选的潮霉素B和G418抗性克隆 100 可调控性重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中的实验研究 47 制备重组逆转录病毒RevTRE HSVtk和RevTet On 然后通过逆转录病毒感染靶细胞 将Tet On基因调控系统中的反应元件TRE和rtTA调控元件共同整合到同一宿主细胞中 使目的基因导入靶细胞 并处于Tet On基因的有效调控 同时也提高了外源目的基因的转导效率 48 病毒感染细胞基因组DNA的提取与酶切 图17病毒感染细胞基因组DNA的提取与酶切图M LambdaDNA EcoRI Hind DNAMarker 1 逆病毒RevTRE HSVtk和RevTet On感染MCF 7细胞基因组DNA 2 MCF 7细胞基因组DNA 3 MCF 7细胞基因组DNAEcoRI酶切 4 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On感染MCF 7细胞基因组DNAEcoRI酶切 49 逆病毒感染细胞Southern印迹杂交分析 M123 图18细胞Southern印迹杂交分析图M 100bpladdermarker 1 MCF 7细胞 2 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On一次感染的MCF 7细胞 3 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On重复感染的MCF 7细胞 50 利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病毒RevTRE HSVtk和RevTet On导入乳腺癌细胞株MCF 7细胞 实验中观察到 HSVtk基因的表达受Dox的诱导调控 随着Dox的浓度增高 GCV对乳腺癌细胞的杀伤能力加强 51 台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力 图19不同Dox浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数 52 MTT法检测重组病毒感染的MCF 7细胞不同药物浓度诱导24h的存活率 n 4 n 4 53 流式细胞分析 图20流式细胞仪 FCM 检测细胞凋亡图1 MCF 7细胞 2 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On感染的MCF 7细胞 3 1 g mlDox 2 g mlGCV作用48h的逆转录病毒感染MCF 7细胞 54 流式细胞仪 FCM 检测细胞周期 图21流式细胞仪 FCM 检测细胞周期图1 MCF 7细胞 2 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On感染的MCF 7