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一 色谱技术回顾 色谱的起源 色谱法是什么 色谱法最早出现 是俄国植物学家Tswett于1903年在波兰华沙大学研究植物的叶子组成时 用碳酸钙作为吸附剂 分离植物干燥叶子的石油醚萃取物 植物的色素吸附在管内的碳酸钙里 再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素 于是管内的碳酸钙上形成了三种颜色的6个色带 当时 Tswett把这种色带叫做 色谱 其英文译名为Chromatography 这一方法中的碳酸钙成为 固定相 而纯净的石油醚被称为 流动相 Tswett的方法就成为液固色谱 Liquid SolidChromatography TewettM BerDtschBotGes 1906 24 316 内容 一 色谱技术回顾二 高效液相色谱法及色谱基本语言三 培训设备四 溶剂准备五 LC3000色谱仪组成六 LC3000系统基本操作七 HPLC维护知识 分离结果 流动相 固定相 起源 Tewett1903 色谱技术回顾 色谱技术回顾 色谱法的原理 图形化解释色谱法100米短跑8位选手位于起跑线上开始 样品溶液在进样阀 跑道阻力 空气阻力 色谱柱 肌肉动力 输液泵 拍照和终点线 检测器 秒表 工作站 色谱分离的机理 色谱分离是一个物理的过程 流动相 MobilePhase 固定相 StationaryPhase 样品 溶解于流动相中的溶质 色谱技术回顾 色谱技术回顾 色谱法是什么 色谱法是利用不同性质的物质在不相混溶的两相中分配系数 吸附解吸附或其它性能不同而被分离 色谱技术回顾 常规分类方法 按流动相的物态分 气相色谱 GasChromatography GC 用气体作为流动相 又叫载气 液相色谱 LiquidChromatography LC 用液体作为流动相 又叫洗脱剂 超临界流体色谱 是指使用条件 超过了流动相的临界温度和压力 以CO2为代表 按固定相的形态分 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱按流动相和固定相的相对极性分 正相色谱 NormalPhaseChromatography 固定相的极性大于流动相 反相色谱 ReversedPhaseChromatography 固定相的极性小于流动相 反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度 水 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 异丙醇 四氢呋喃最常用的流动相组成 甲醇 水 乙腈 水 正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度 正己烷 乙醚 乙酸乙酯 异丙醇 应用添加剂 成为离子对 离子抑制方法 色谱技术回顾 按分离过程的机理分 吸附色谱 AbsorptionChromatography 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 分配色谱 PartitionChromatography 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度 分配系数 不同 离子交换色谱 IonExchangeChromatography 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离 简称离子色谱 IC 体积排除色谱 SizeExclusionChromatography GPC GelPermeationChromatography 凝胶渗透色谱法 固定相是疏水性凝胶 流动相是有机溶剂 GFC GelFiltrationChromatography 凝胶过滤色谱法 固定相是亲水性凝胶 流动相是水溶液 什么是高效液相色谱 HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法 简称 HPLC是一种区别于经典液相色谱 基于仪器方法的高效能分离手段 高性能的色谱柱 高精度 耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域 医药 环保 石化 生命科学 食品及农业 二 高效液相色谱 与经典液相色谱 柱色谱 比较 高效液相色谱 发展 液相色谱仪的两大主要用途 高效液相色谱 色谱图 HPLC图形结果 Chromatogram 色谱峰 保留时间 分 基线 峰高 峰宽 响应值 色谱图 液相色谱图相关术语 峰高 PeakHeight峰最大值到峰底的距离半 高 峰宽 PeakWidthatHalfHeight通过峰高的中点作平行于峰底的直线 其与峰两侧相交两点之间的距离峰面积 PeakArea峰与峰底之间的面积 又称响应值 液相色谱图相关术语 基线 Baseline在正常操作条件下 仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移 BaselineDrift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声 BaselineNoise由各种因素所引起的基线波动 液相色谱图相关术语 死体积 V0 Deadvolume不被固定相滞留的组分 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积保留体积 VR Retentionvolume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 死时间 t0 Deadtime不被固定相滞留的组分 从进样到出现峰最大值所需的时间保留时间 tR Retentiontime组分从进样到出现峰最大值所需的时间 柱效 色谱柱的分离效率理论塔板数 用于定量表示柱效 假设一根柱子可以分为N段 在每段内组分在两相间很快达到平衡 把每一段称为一块理论塔板 设柱长为L 理论塔板高度为H 则H L N 式中N为理论塔板数 经验计算公式 N L 2d d为填料的直径 理论塔板数N与柱长有关 当比较两不同长度的色谱柱的柱效时 应当比较它们在相同柱长下的N值 液相色谱相关术语 液相色谱相关术语 拖尾因子 Tailingfactor Tf峰高5 处的峰宽与峰极大到前伸沿之间二倍距离之比Tf A B 2A不对称因子 Asymmetry As峰高10 处的前沿峰宽比后沿峰宽As A B 柱效测试参考方法 条件 100 250mm制备柱 流速 150 250mL min流动相 CH3OH 90 CH3OH H2O 进样体积 1 2mL检测波长 254nm样品名称 苯 甲苯 萘 蒽样品浓度 1mg ml 1ml 100ml 环境温度 柱压 柱效 拖尾因子 柱效图谱 分离度 简单说来 分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远 液相色谱相关术语 液相色谱方法开发 液相色谱实验所需的基本参数流动相 种类及配比 等度或梯度固定相 色谱柱类型及内径 长短流动相输送系统参数 流速检测器参数 紫外检测波长 灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法 亦称色谱条件 线性色谱与非线性色谱比较 线性色谱的特点有三 保留行为 时间 体积 只与样品本身有关 与浓度无关 峰高或峰面积与浓度成比例 在线性范围里色谱峰是高斯峰 对称分布非线性色谱的特点也有三 一 色谱峰保留行为 时间 体积 不仅与样品本身有关 还与浓度无关 二 峰高或峰面积与浓度不成比例 三 色谱峰是不对称的 三 培训设备 二 培训设备CXTHLC3000色谱仪P3000高压输液泵UV3000紫外检测器7725i手动进样阀T2000柱温箱 可选 C18色谱柱250 4 65u 可选 其它色谱基本条件 流动相准备 电脑和实验台等 四 溶剂准备 1 条件 色谱级纯或者优级纯甲醇或者乙腈 ACN 二次蒸馏水2 流动相的过滤和超声3 样品的前处理和过滤 五 LC3000色谱仪组成 1 P3000泵 一元 等度 系统两元 梯度 系统 P3000泵界面和基本操作 泵内部结构 工作原理简介图 泵头以及传动结构图 泵头以及传动结构图 液相色谱泵主要耗材 单向阀及内部结构 单向阀 单向阀内部结构 基本操作 泵的基本操作可以通过CXTH 3000工作站 推荐使用 或者泵仪器面板控制 以下是泵面板的基本控制按钮PUMP STOP键 按一下该按键可以运行泵 再按一下停止泵运行 START HOLD键 按一下该键运行预先设定的程序链 PROGRAM 再按一下保持此时的程序运行PURGE键 冲洗键 按一次泵按照 SYSTEMSETING 系统设定中设定冲洗流量运行冲洗 再按一次泵停止冲洗 作用 冲洗泵头气泡和快速更换流动相 DEL键 退出键或者删除键 进入子菜单下通过此键退回上一菜单 ENTER键 进入键或者确认键 按该键进入子菜单 方向键 光标的上下左右移动 常见问题 泵的密封垫 泵的密封垫是最易损耗的部件 密封垫的损坏会引起系统的多种故障 渗漏和垫圈碎片会污染系统 密封垫磨损是不能避免的 一定的保养会延长其寿命 1每天使用完毕后将泵头中的缓冲盐置换掉 2使用色谱级流动相3贮液瓶中加装入液管口过滤器4保持仪器在较低压力下运行 常见问题 单向阀 单向阀失灵 球与阀座密封不严 造成液流倒流压力不稳 或者球与阀座粘在一起阻死 密封不严是污染或者气泡引起的 球与阀座粘在一起是由于污染或者磨损造成的 可取出单向阀放入甲醇 乙腈 稀硝酸内超声15min 再反复用甲醇 水冲洗数次 泵参数 P3000A型高压输液泵流量范围 分析型0 001 9 999mL min半制备型0 01 49 99mL min流量精确度 0 5 1mL min 流量准确度 RSD 0 1 1mL min P6000制备型高压输液泵流量范围 1 1000mL min 依不同配置有所变化 流量精确度 1 流量准确度 RSD 0 5 P6000 3L型高压输液泵流量范围 1 3000mL min流量精确度 1 流量准确度 RSD 0 5 2 UV3000检测器 检测器内部结构 紫外检测器主要耗材 工作原理 是基于光的吸收定律朗伯 比耳定律 该定律指出 当一束单色光辐射通过物质溶液时 如果溶剂不吸收光 则溶液的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比 工作原理图 UV Vis检测器的原理 UV检测器是一种光吸收型检测器 它主要基于朗伯 比尔定律 A log I0 I logI0 logI L C其中 A 吸光度I0 入射光强度I 透射光强度 摩尔吸光系数L 流通池的光程C 样品浓度 常见问题 流通池污染或者气泡滞留充分脱气的流动相或异丙醇快速通过流通池会带走气泡 池污染也可使用上法但不一定奏效 可在流通池前后接上PEEK管 用注射器回抽异丙醇 稀硝酸 水来冲洗掉污染 若说明书上未指明 流通池只可在低压下使用 主要参数 UV3000型紫外分光检测器波长范围 190 700nm 氘灯 可选钨灯 波长精确度 1nm波长重复性 0 2nm基线噪声 1 10 5AU基线漂移 4 10 4AU hUV6000型制备紫外分光检测器波长范围 190 700nm 氘灯 可选钨灯 波长精确度 2nm波长重复性 0 4nm基线噪声 3 10 5AU基线漂移 1 10 3AU h 常见问题 流通池污染或者气泡滞留充分脱气的流动相或异丙醇快速通过流通池会带走气泡 池污染也可使用上法但不一定奏效 可在流通池前后接上PEEK管 用注射器回抽异丙醇 稀硝酸 水来冲洗掉污染 若说明书上未指明 流通池只可在低压下使用 主要参数 UV3000型紫外分光检测器波长范围 190 700nm 氘灯 可选钨灯 波长精确度 1nm波长重复性 0 2nm基线噪声 1 10 5AU基线漂移 4 10 4AU hUV6000型制备紫外分光检测器波长范围 190 700nm 氘灯 可选钨灯 波长精确度 2nm波长重复性 0 4nm基线噪声 3 10 5AU基线漂移 1 10 3AU h 3 进样阀 六通进样阀关键部件由圆形密封垫 转子 和固定底座 定子 组成 六通阀的构造a Load状态b Inject状态 进样阀概述 7725i是6通道阀 阀的背面有数字标号 2号口为流动相进口 泵连接到阀 3号口为流动相出口 阀连接到色谱柱 1号口和4号口为定量环接口 默认连接的为20微升 可以更换 5口和6口为废液口 进样口为阀前端口 实际上7725i有7口 以上俗称 2进3出 1 4定量 5 6废液 基本操作及注意事项 基本操作 进样阀前端有LOAD 装样 和INJECT 进样 两个标示 当阀的把手在LOAD的状态下时 此时处于装样的状态 当样品注入后将阀扳到INJECT状态 进样过程完成 进样注意事项 A 缓慢进样 快速扳阀 阀不要处于中间位置 B 如果使用缓冲盐 当天使用后要使用含5 有机相的水溶液清洗进样阀 4 色谱柱 色谱柱标示 如 Kromasil250 4 65u100A分别代表填料名称柱长内径填料大小填料比表面积色谱柱基本常识 其他条件相同 柱子越长 保留时间越长 其他条件相同 柱内径越小 柱压越高 其他条件相同 柱填料颗粒越小 柱压越高 不同品牌的色谱柱将有不同的特性 如保留时间 柱效等 同等流速下 不同流动相的柱压将不同 包括流动相组分配比的变化也会导致压力变化 原因是 流动相组分的比例变化导致流动相粘度的变化 从而导致压力的变化 基本安装注意事项 基本安装注意事项 A 避免死体积 漏液或损坏柱子使用正确的接头尽可能缩短连接管路长度 降低柱外效应管路切口必须平整在接上色谱柱前先将管路中的气泡赶净B 色谱柱安装的方向性接头不可拧太紧打开输液泵 检查柱是否漏按照色谱柱上箭头指示的方向为流动相经过的方向 六 LC3000系统基本操作 1 打开计算机 2 打开LC3000各部分 P3000泵 UV3000检测器等 电源 3 待检测器和泵自检完成后 双击打开CXTH 3000 中文版 工作站软件图标 4 将入液管放入到过滤超声好的流动相中 5 拧开排空阀 将泵冲洗流量设定5ml min 点击泵面板上PURGE键 此时泵开始运行冲洗功能 直到管线内 由溶剂瓶到泵入口 无气泡为止 再按PURGE键或者PUMP STOP键停止冲洗 6 关闭排空阀 设置工作站上控制面板中时间程序 7 点击工作站上采集基线图标 观察基线稳定情况 8 点击停止采集 进样扳阀 触发工作站采集谱图 9 保存谱图到指定位置 10 谱图处理和谱图校正 11 打印报告 12 实验结束前 用纯甲醇或者其他纯有机相清洗系统 13 关闭工作站和仪器电源 HPLC维护知识 1 为什么溶剂和样品要过滤 溶剂和样品过滤非常重要 它会对色谱柱 仪器起到保护作用 消除由于污染对分析结果的影响 色谱柱 由于填料颗粒很细 筛板孔径和色谱柱内腔很小 溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞 仪器 溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损 同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损 2 为什么HPLC在使用缓冲盐时要使用柱塞后冲洗 HPLC用缓冲盐时 由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压盐析现象 析出的细小盐粒非常坚硬 它附着在蓝宝石活塞杆上 随着蓝宝石活塞杆的往复运动 容易产生划痕 并磨损密封垫 造成漏液等故障现象 使用有效的柱塞后冲洗能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶 缓冲盐的浓度在0 1mol或者大于0 1mol时 必须使用柱塞后冲洗 清洗液配制 90 水 10 异丙醇 该混合液可以抑制菌类生长和减小水的表面张力 以2到3滴 分钟的流速虹吸留下即可 HPLC维护知识 3 为什么流动相在使用前需要进行脱气处理 流动相在使用前必须进行脱气处理 以除去其中溶解的气体 如氧气 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时 因压力降低而产生气泡 气泡会增加基线的噪音 造成灵敏度下降 甚至无法分析 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能 若用FID 可能会造成荧光淬灭 常用的脱气方法比较 氦气脱气法 利用液体中氦气的溶解度比空气低 连续吹氦气脱气 效果较好 但成本高 加热回流法 效果较好 但操作复杂 且有毒性挥发污染 抽真空脱气法 易抽走有机相 超声脱气法 流动相放在超声波容器中 用超声波振荡10到15分钟 此效果最差 在线真空脱气法 在线脱气 智能控制 无需额外操作 成本低 使用于多元溶剂混合系统 HPLC维护知识 4 手动进样阀需做哪些维护 使用时需要注意什么 A 对于手动进样器 当使用缓冲溶液后 或者进浓度差异大的样品时 要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口 同时扳动进样阀数次 每次数毫升 B 安装时流通阀的5口和6口要与注射器在同一水平线上 以防止虹吸现象的发生 导致进样量的重复性变异 C 进样量的多少要根据定量管 LOOP 体积决定 当样品量少时 进样体积由注射器的进样体积决定 但最大进样体积要小于1 2LOOP体积 当样品量较多时 进样体积由定量管的体积决定 为保证样品完全把定量管的流动相置换干净 需注射大于2 5倍定量环的体积 D 要使用专用的液相进样针进样 绝对不能使用气相进样针 HPLC维护知识 5 检测器流通池需要怎样维护 故障表现在什么方面 当检测器采集基线为有规律的三角峰 或者毛刺峰时 很有可能是检测器中流通池存在气泡 可以通过增加适当的反压排除气泡 或者将流通池拆下用洗耳球将气泡吹出 当系统在平衡一段时间后 仍然出现基线漂移大的情况下 也有可能是流通脏导致检测器样品能量值下降 常说的R值 此时我们需要采用30 的稀硝酸清洗流通池 然后用含有5 有机相的清水冲洗 知道干净为止 一般通过观察基线稳定为止 6 用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移 有时发生快速变化 原因何在 如何解决 A 温度控制不好 解决方法是采用恒温装置 保持柱温恒定B 流动相发生变化 解决办法是防止流动相发生蒸发 反应等C 柱子未平衡好 需对柱子进行更长时间的平衡7 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么 A 筛板堵塞或柱失效 解决办法是反向冲洗柱子 替换筛板或更换柱子B 存在干扰峰 解决办法为使用较长的柱子 改换流动相或更换选择性好的柱子 HPLC维护知识 8 除了流速外 还有哪些因素能引起压力改变 A 改变流动相组成和温度 B 改变柱长 柱内径和填料粒度 C 柱突然阻塞压力升高 正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的 9 怎样才会使峰位发生重排 在分析多组分样品时 仅改变流