Real-time-PCR-原理及其定量方法.ppt

实时荧光定量PCR原理及其定量方法 同济大学唐蔚 实时荧光定量PCR原理和定量方法 一 荧光定量PCR的原理 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程 对起始模板进行定量分析的方法 三个关键词 实时 定量 荧光 1 定量与常规PCR的差别 常规PCR技术 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析 定量PCR技术 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析 2 荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线 阈值 CT值 Cycle NormalisedreporterFluorescence Rn Baseline Exponentialphase plateauphase Thresholdline CtValue Linerphase 1 扩增曲线 Amplification 反映PCR循环次数和荧光强度变化的曲线 随着PCR反应的进行 每经过一个循环 收集一次荧光信号 通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化 从而得到扩增曲线图 纵坐标 Rn 荧光值 横坐标 cyclenumber 循环数 线性图 对数图 荧光信号变化与PCR循环数的变化直观 荧光信号变化的对数与PCR循环数的变化确定阈值线 2 阈值 Threshold 在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 它可以设定在荧光信号指数期任意位置上 一般荧光域值设置是基线荧光信号 一般是PCR3 15个循环荧光信号 的标准偏差的10倍 前15个循环信号作为荧光本底信号 baseline 荧光阈值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 进入指数期的最初阶段真正的信号 荧光信号超过阈值 3 Ct值 Cyclethreshold PCR过程中 每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时 所经过的扩增循环数 相同模板进行多次扩增 终点处产物量不恒定 但Ct值极具重现性 3 荧光定量PCR的数学原理 Xn 第n次循环后扩增产物数量 在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为Ct个循环 此时 XCt X0 1 Ex Ct M XCt 荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量 在阈值设定以后 它是一个常数 设为M 上式两边同取对数得 LogM LogX0 1 Ex Ct 整理得 LogX0 CtLog 1 Ex LogM 另一种思路由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成正比 所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量 同时考虑荧光本底值 则 Rn RB X0 1 Ex Rs 总荧光信号强度 本底信号 分子数量 单位信号强度 Rn 第n个循环时的总信号RB 本底RS 单位信号强度X0 起始DNA数目Ex PCR扩增效率 类似的 当循环数n等于Ct值时 可推出 Ctlg 1 Ex lgX0 lg RT RB lgRs变形得 此时 PCR反应处于指数期阶段 所有样品的反应效率Ex稳定且近似相等 lg RT RB Rs也都相同 只有Ct值和 lgX0为变量 且这两个变量之间成线性关系 也就是说 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量 线性关系 扩增效率确认 扩增效率 扩增效率理论值为1 即每增加一个循环PCR产物加倍 那么 根据扩增效率Ex与标准曲线斜率的关系 优化的标准曲线斜率应该为 3 32 4 荧光定量PCR的化学原理 处于基态的分子经某种波长的入射光照射 吸收电磁辐射后被激发至激发态 然后通过发光的形式释放出能量 重新跃迁回基态 所发射的光即为荧光 荧光定量PCR反应体系 非特异性荧光标记DNA结合染料 SYBRGreen 特异性荧光标记探针 Taqman Beacon FRET Amplifluor 引物 Scorptionprimer LUXprimer 1 SYBRGreen法 SYBRGreen染料可以与dsDNA小沟区结合并发出绿色荧光 游离状态下SYBRGreen仅发出微弱荧光 与dsDNA结合后荧光强度激增 其荧光信号强度与dsDNA数量成正比 融解曲线 meltcurve 在PCR反应程序结束后 逐步提高温度 读取荧光值 得到温度与荧光值的关系曲线 融解温度 meltingtemperature Tm值 双链DNA解链50 的温度 一般而言 退火 annealingtemperature 温度等于Tm值减5 融解曲线原始图 融解曲线单峰图 融解曲线的设置是在PCR反应完成后进行的 一般从60 升到90 得到的融解曲线随着温度的升高 双链DNA的解链 荧光信号不断降低 且在Tm值下降速度最快 用荧光信号强度改变的负的一次导数与温度做图 即得到单峰的融解曲线 峰值代表斜率改变最大值 即为Tm值 融解曲线分析可以优化PCR反应条件 可区分单一引物 引物二聚体 变异产物等 SYBRGreen法优缺点 2 TaqMan探针法 水解型杂交探针 Taqman荧光探针为一寡聚核苷酸序列 其两端分别标记一个报告基团 荧光发射基团 和一个猝灭基团 探针完整时 发射基团发射的荧光信号被荧光猝灭基团所吸收 无荧光信号被检测 当PCR扩增时 Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可酶切水解探针 使荧光发射基团和淬灭基团分离 荧光共振转移 FRET 效应消失 系统可检测到荧光信号 荧光信号强度与结合探针的DNA量成正比 常用的荧光基团主要有FAM TET HEX等 TaqMan作用机理 TaqMan法优缺点 3 分子信标Beacon法 发夹型杂交探针 分子信标是呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开常用的荧光基团有FAM TexasRed 4 FRET法 FRET探针又称双杂交探针 由两条相邻探针组成 在一条探针的5 端标记FAM荧光基团 另一探针的3 端标记Red640荧光基团 复性时 探针结合在模板上 FAM基团和Red640基团相邻 激发FAM产生的荧光作为Red640基团的激发光被吸收 使Red640发出640nm的荧光 变性时 探针游离 两基团距离远 不能产生640nm的荧光 二 荧光定量PCR的定量方法 绝对定量和相对定量 绝对定量 Log 起始浓度 与循环数呈线性关系 通过已知浓度的标准品作出标准曲线 即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值 就可以计算出初始样品中所含的模板量标准品可以是纯化的质粒DNA 体外转录的RNA或者体外合成的ssDNA 绝对定量实验构建流程 绝对定量分析要素 一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列 一组标准样本 用来生成标准曲线 可以是含有目的基因的质粒 PCR产物 基因组DNA等 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应 以确保统计显著性 标记方法的选择 SYBRGreen法或探针法均可 实验结果显示 扩增曲线 标准曲线 融解曲线 探针法不需要 质粒标准品的制备 目的基因克隆 质粒提取 OD值定量 拷贝数计算 待测DNA样本浓度 ng ul OD260 50 稀释倍数1dolton即表示1g mol 1摩尔 6 02 1023摩尔分子 拷贝数 待测样本拷贝数 copies ul DNA样本浓度 样本分子量 6 1023 10 9 DNA浓度 ng ul 660 bases 6 1023 10 9 绝对定量实验举例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 方法 从血液中提取病毒DNA 以TaqMan探针法进行荧光定量检测试剂 TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMixProbe标准品 质粒标准品浓度为106 105 104 103 2个重复 设阴性空白对照实验步骤 提取HBVDNA 设计引物 设计TaqMan探针并标记探针 荧光定量扩增 结果分析 获取血液样品中HBVDNA的精确copy数 96孔板设置举例 实验数据 扩增效率E的计算E 10 1 斜率 1 10 1 3 29 1 2 01 1 1 01 标准曲线拟合 利用MeanCt作图可得到标准曲线 y 3 29x 40 33R2 0 9978 未知样品拷贝数计算 将Ct值带入线性方程 20 5 3 29X 40 33 QuantitySample 106 03 1071519copies 因为 这里算出的X其实是logX0 X0起始DNA模板数 相对定量法 必要性 理论上目的基因表达量分析条件 SampleB SampleA 关注点 基因的相对表达量 而不是基因的绝对量 实际目的基因表达量分析 相对定量分析要素 一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因 用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应 以确保统计显著性 标记方法的选择 SYBRGreen法或探针法均可 实验结果显示 扩增曲线 标准曲线 有些分析方法不需要 融解曲线 探针法不需要 一组标准样本 有些分析方法不需要 内参基因 校正上样量 上样过程中存在的实验误差 保证实验结果的准确性 理想的内参基因应该满足以下条件 不存在假基因 Pseudogene 高度表达稳定表达于不同类型的细胞和组织 且其表达量近似 无显着性差别表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关其稳定的表达水平与目标基因相似不受任何内源性或外源性因素的影响 如不受任何实验处理措施的影响 相对定量方法 相对定量实验构建流程 双标准曲线法 公式 待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度F 对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度 由于所测的待测基因浓度和内参基因浓度都是根据目的基因和内参基因的标准曲线来确定的 故称为双标准曲线法 优点 分析简单 实验优化相对简单缺点 对每一个基因 每一轮实验都必需做标准曲线适用条件 内参基因和目标基因扩增效率不同扩增效率较低 这里 数据处理举例 假设检测A基因在某因子干预下的表达 得到一组数据结果如下 2 Ct法 优点 无需作标准曲线缺点 实验条件优化较为复杂适用条件 内参基因和目标基因扩增效率接近 均接近100 标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致 公式 目标基因和内标基因扩增效率的快速检测 通过并列跑两条扩增曲线 查看指数增长期的曲线之间是否平行 验证试验 目的基因和内参基因扩增效率一致性检测检测目标基因与内参基因在不同稀释浓度下的 Ct 以稀释倍数与 Ct作图 当直线的斜率近似于0 绝对值应小于0 1 时 说明目标基因与内参基因扩增效率一致 2 Ct法公式推导 XT是目标分子达到设定的阈值时的分子数RT是内参分子达到设定的阈值时的分子数 假设目标序列与内参序列扩增效率相同 或 最后用任一样本q的XN除以参照因子 calibrator cb 的XN得到 对于一个少于150bp的扩增片断而言 如果Mg2 浓度 引物都进行了适当的优化 扩增效率接近于1 因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是 修正方法 如果知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率 但扩增效率不等于2 那么2 Ct可以修正为用实际扩增效率值代替2 即E Ct 例如扩增效率为1 95 那么计算公式可修正为1 95 Ct 数据处理举例 以1号