桂花DNA的提取与定量分析.docx

一、 野菊花DNA的提取一、实验原理：脱氧核糖核酸 （deoxribonucleicacid， DNA） 是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取 DNA 的常规技术之。从细胞中分离得到的 DNA 是与蛋白质结合的 DNA，其中还含有大量 RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 DNA 不溶于 0.14mol/L 的 NaCl溶液中，而 RNA 则能溶于 0.14mol/L 的 NaCl 溶液之中，利用这性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有 Dnase 释放到提取液中，使 DNA 因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和 EDTA， 既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离， 再加入阴离子去垢剂 0.15的 SDS，经过 2h 搅拌，或用氯仿 异戊醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用 95的预冷乙醇即可把 DNA 从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。二、试验试剂：1、研磨缓冲液：称取 59.63gNaCl，13.25g 柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用 0.2mol/L 的 NaOH 调至 pH7.0，并定容至1000ml；2、 10 SSC溶液：称取87.66gNaCl和 44.12g 柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至 1000ml；3、1 SSC 溶液：用10 SSC 溶液稀释 10 倍；4、0.1 SSC 溶液；用 1 SSC 溶液稀释 10 倍；5、Rnase 溶液：用 0.14mol/LNaCl 溶液配制成 25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH 至 5.0，使用前经 80水浴处理 5min（以破坏可能存在的Dnase）；6、氯仿异戊醇：按 24ml 氯仿和 1ml 异戊醇混合；7、5mol/L 高氯酸钠溶液：称取 NaClO4H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至 100ml；8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将 SDS 放入无水酒精中达到饱和为止，然后在 7080的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用；9、1molL HCl；10、0.2mol/L NaOH；11、二苯胺乙醛试剂：1.5g 二苯胺溶于 100ml 冰醋酸中，添加 1.5ml 浓硫酸， 装入棕色瓶， 贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液浓乙醛： H2O1:50（VV）；12、1.0mol/L 高酸溶液（HClO4）；13、0.05mol/LnaOH；14、DNA 标准液：取标准 DNA 25mg 溶于少量 0.05mol/LNaOH 中，再用 0.05mol/LNaOH 定容至 25ml，后用移溶管吸取此液 5ml 至 50ml 容量瓶中，加 5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用 0.5mol/LHClO4 定容至刻度，则得100g/ml 的标准溶液。三、实验步骤：1、称取野菊花 10g 剪碎置研钵中，加 10ml 预冷研磨缓冲液并加入0.1g 左右的 SDS，置冰浴上研磨成糊状。 2、将匀浆无损转入 25ml 刻度试管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，加上塞子， 剧烈振荡 30s， 转入离心管， 静置片刻以脱除组织蛋白质。以 4000rpm离心 5min。3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4、将试管置 72水浴中保温 3min（不超过 4min），以灭活组织的 DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加 5mol/L 高氯酸钠溶液提取液： 高氯酸钠溶液4： 1 （VV） ，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为 1mol/L。5、再次加入等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中， 振荡 1min， 静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6、用滴管吸 95的预冷乙醇， 慢慢地加入烧杯中上清液的面上， 直至乙醇的体积为上清液的两倍， 用玻璃棒轻轻搅动。 此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7、然后加入 0.5ml 左右的 10 SSC，使最终浓度为 1 SSC。8、重复第 6 步骤和第 7 步骤即得到 DNA 的粗制品。9、 加入已处理的 Rnase 溶液， 使其最后的作用浓度为 5070g/ml， 并在37水浴中保温 30min，以除去 RNA。10、加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡 1min，再除去残留蛋白质及所加 Rnase 蛋白，室温下以 4000rpm 离心 5min，收集上层水溶液。11、再按 6、7 步骤处理即可得到纯化的 DNA 液。二、 DNA的含量测定紫外吸收法一、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质。核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用（P）表示。（P）为每升溶液中含有1摩尔核酸磷时的吸光度（即光密度，或光吸度）。RNA的（P）260nm（pH7）为77007800，RNA中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0g RNA的吸光度为0.0220.024。小牛胸腺DNA钠盐的（P）260nm（pH7）为6600，含磷的质量分数为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0g DNA钠盐的吸光度为0.020。不同形式DNA紫外吸光度不同，因为DNA具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA变性，则出现（P）260nm值升高的增色效应现象。在核苷酸量相同的情况下，（P）260nm有以下关系：单核苷酸单链DNA双链DNA。DNA变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，还可根据DNA溶液在260nm出吸光度的变化监测DNA变性情况。变性复性后，（P）260nm值降低，称为减色效应。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm波长处，在260nm处的吸光度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。在260nm与280nm处的吸光度的比值在2.0以上，DNA在260nm与280nm处的吸光度的比值为1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。紫外吸收发测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ng/L的检测水平。二、实验器材：紫外分光光度计，容量瓶（50mL），离心管，离心机。三、实验材料、试剂：（1）DNA样品；（2） 钼酸铵过氯酸沉淀剂（0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液）：将3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。四、实验步骤：1、取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品和0.5ml蒸馏水；乙管加入0.5ml样品和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴中放置15min，以3000r/min离心10min，分别取上