动物转基因克隆的分子生物学基础.ppt

热烈祝贺 生命科学博士后研讨会 召开 中国农业大学 动物转基因与克隆的研究进展 李宁 超级鼠转GH基因的鼠 4 异种器官移植 乳腺生物反应器 转基因育种 血液 器官 药用蛋白 生长 羊毛 营养保健 HemoglobinDNXBiotherapeuticsInc HeartImutranLimited KidneyNextran a1 AntitrypinPPLTherapeuticalsplc AntithrombinIIIGenzymeTransgenicCorp LactoferrinPharmingB V GlycoconjugatesRossProductsCorp GH IGF IPigBreeding BresgenLtd MP IGF ISheepBreeding AgRes TRANSGENICANIMALSWhereIsthePotentialforApplication 5 转基因动物研究的里程碑 196619771980 19811981198219831985198719891994199719981999 配子的微注射技术建立mRNA和DNA转移爪蟾卵细胞转基因小鼠获得成功小鼠胚胎干细胞转移转基因 超级鼠 转基因小鼠组织特异性表达转基因家畜嵌合体 敲除 鼠成功定位整合的种系嵌合体小鼠精子细胞的移植绵羊的体细胞克隆利用核移植技术产生转基因绵羊 敲除 家畜获得成功和 Doogie 鼠 6 Robert Bob Wall KeyPlayerinUSA KeithCampbell KeyPlayerinUK 7 转基因动物的制作技术 原核期胚胎的显微注射逆转录病毒载体注射MII期的卵母细胞精子头与外源DNA合并注射卵母细胞体细胞核移植技术制作转基因动物逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎原始生殖细胞技术精子载体方法胚胎干细胞技术 8 MicroinjectionManipulationFacility 9 利用转基因动物制药的途径 血液 尿腺 乳腺 禽卵 昆虫 120亿美元 年的全球市场 20亿美元 年药用蛋白专利过期 10 StrategyforProductionofHumanMedicinebyTransgenicAnimals 11 转基因奶牛和细胞培养技术生产抗体蛋白的成本比较 美国商业交流公司 Genzyme公司和D MD医药投资发展公司报告 12 美国商业交流公司 Genzyme公司和D MD医药投资发展公司报告 动物乳腺生物反应器生产人用药物蛋白的现状 13 InterNutria报告 NatureBiotechnology16 8 728 731 1998 动物乳腺反应器生产人医用营养保健蛋白的现状 人乳化 牛奶是最好的医用营养保健品 15 人乳与牛乳主要成分的比较 Humanmilk Bovinemilk Carbohydrares LactoseOligosaccharides Proteins Caseinsa LactalbuminLactoferrinSecretoryIgALysozymeb lactoglobulin Lipids TriglyceridesPhospholipids Minerals SodiumPotassiumChlorideCalciumMagnesium 73g l12g l 40g l1 0g l 3 0g l1 8g l1 5g l1 4g l1 2g lnone 28g l1 2g lTrace0 03g l0 03g l3 6g l 4 0 0 04 4 0 0 04 5 0mM15mM15mM8 0mM1 4mM 15mM45mM35mM30mM4 0mM 16 人奶与牛奶的功能差异及其优缺点 Casein wheyprotein 30 70 80 20 Problems hardcurdinthestomachanddietaryproteinallergy Cysteine methionine high low Phenylalanine tyrosine low high Problems retardationofbraindevelopmentandPKUbabies HUMAN COW Calcium phosphate 2 3 1 1 26 1 Problems hypocalcemia tetanyandhyperphosphatemia 17 PersonalBallisticProtection superiorenergy to break mechanicalpropertieswithweight25 lighterthanaramid basedfibers MedicalMaterials highstrengthsuturesandprostheticdevices PersonalHealthcare cosmeticformulationtoprovidesupportandelasticitytoskin IndustrialComponent improvethestrengthprofileforautomotiveandmilitaryandaerospacecomponents 生物钢 材料的应用领域 18 生物钢 的应用领域与发展需求 国防用 生物钢 新型生物材料的生产 医用人工韧带 关节等生物材料的生产 高附加值特殊用途 粘性蛋白等的生产 欧美市场估计为150亿美元 年中国市场估计为100以人民币 年 19 转基因奶羊和细胞培养技术生产抗体蛋白的成本比较 20 TheComparisonbetweenDifferentFermentationTechnology 21 美国商业交流公司 Genzyme公司和D MD医药投资发展公司报告 22 Time FinancialRequiredforDevelopmentofTherapeuticalsbyTransgeniccattle 23 GenzymeTransgenicCorpFoundin1992 andthefarmwasConstructedin1995 ThetotalEmployeeis672peoplebutonly112ofthemcloselyworkinginThetransgenicplatform TheallOthersareinapharmacologyDivision TheNASDAQpriceperShareisaround18 68US 24 GoatBarninGenzymeTransgenicCorp 25 TheSituationinsidetheGoatBarn 26 27 TransgenicGoatswithaSensorLabel 28 MilkingFacilitiesforTransgenicGoats 29 PURIFICATONFACILITIES PPLTherapeuticsplc 31 China 863 High TechProgram Z21 04Productionoftherapeuticalproteins Development1 CAU2 SMI3 MMI4 NGC5 XJI Research1 CAU2 MAU3 HIU4 GXU5 SBI6 VRI 32 TransgenicDairyGoatwithHumanmATTGene 33 TransgenicDairyGoatwithHumanmATTGene 34 生产人营养保健 医疗 品 一种药物需要10年以上的开发时间和至少2 5亿美元的资金才有可能走向市场 而营养医用品只需要几百万美元和几年的时间 更重要的是 营养医用品的利润也非常大 Dr LewisLepene InterNutria公司执行总裁 35 InterNutria报告 NatureBiotechnology16 8 728 731 1998 ProductiontheHuman LikeMilkbyState of the ArtTechnology ProgramfortheProductionofNutraceuticalsbyTransgenicCow Genecassette Microinjection Transfection Selection NT Transfer Newborns Market 38 ExpansionoftheFounderTransgenics A I Selection 40 Time FinancialRequiredforDevelopmentofNutraceuticalsbyTransgeniccattle 41 ComparisonofMilkComponentbetweenHumanandCow Humanmilk Bovinemilk Carbohydrares LactoseOligosaccharides Proteins Caseinsa LactalbuminLactoferrinSecretoryIgAb lactoglobulin Lipids TriglyceridesPhospholipids Minerals SodiumPotassiumChlorideCalciumMagnesium 73g l12g l 40g l1 0g l 3 0g l1 8g l1 5g l1 4g lnone 28g l1 2g lTrace0 03g l3 6g l 4 0 0 04 4 0 0 04 5 0mM15mM15mM8 0mM1 4mM 15mM45mM35mM30mM4 0mM 42 ProblemsPresentedbyCow MilkFeedingInfantsorHuman Casein wheyprotein 30 70 80 20 Problems hardcurdinthestomachanddietaryproteinallergy Cysteine methionine high low Phenylalanine tyrosine low high Problems retardationofbraindevelopmentandPKUbabies HUMAN COW Calcium phosphate 2 3 1 1 26 1 Problems hypocalcemia tetanyandhyperphosphatemia 43 MedicalFunctionofHumanLactoferrin Bacteriostaticeffectonmicro organismsBacteriolyticeffectonbroadspectrumofbacteriaGrowthstimulatingeffectonbifidusstrainsIrontransportproteinZinctransportproteinTrophiceffectonmucosalcells 44 PossibleApplicationofHumanLactoferrinasTherapeutical hLF hLZasanti infectiousfactorsforpeopleatriskofgastric intestinalinfectione g younginfants elderlypeople patientswithcompromisedimmunologicalresistance hLFasironcarrierforanaemicpeoplee g pregnantwomen elderlypeople anaemicpatients 45 MoreLactoproteinsinDevelopment Lactoperoxidase Antiorcytotoxiceffecttopathogeniccells Prolactin Improvementofimmuno response Zinc transporter Protectionofstuntedgrowth alopecia Dermatitisandzinctransportation Growthfactors Closeoftheleakymucosalliningofnewborn Inhibitionfactors Directlysisofinfectedcells 46 MoreLactoproteinsinDevelopment AldolasetreatmentofhereditaryfructoseintoleranceCatalaseendothelialrecoveryandagingprocessSuperoxidedismutaseskinandorganinadversityLipoproteinlipasedifferenthyperlipidemicdisordersPeroxidaseagainstperoxynitrite mediatedoxidationXanthineoxidoreductasecardiocirculatorydiseaseGalactosyltransferaseresistanttoparasite bacteria 47 影响转基因动物产业化的根本原因 落后的转基因技术 微注射1 转移效率极低 1 2 表达效率极低 1g l 3 不能定点整合 定点进行基因组修饰必将带来转基因动物产业化的革命 48 基因 怀孕产犊 胚胎移植 转基因牛 代孕母亲 表达检测 分子筛选 微注射 胚胎培养 随机整合 传统微注射技术生产转基因动物示意图 总效率0 5 49 核供体动物 体细胞 细胞培养 卵供体动物 未受精卵 除去卵核 细胞融合 克隆胚胎 胚胎移植 无核卵子 代孕母亲 代孕母亲 与核供体遗传相同的克隆牛 动物体细胞克隆提供解决方案 50 核供体动物 体细胞 细胞培养 卵供体动物 未受精卵 除去卵核 细胞融合 克隆胚胎 胚胎移植 无核卵子 代孕母亲 代孕母亲 基因组经过随机整合修饰的转基因克隆牛 细胞筛选 基因整合 阳性细胞扩群 目标基因 基因转移 随机整合 转基因克隆提高了转基因效率 但未解决表达效率和时空表达 51 依赖于基因同源重组的转基因克隆可以同时提高基因整合和表达效率 核供体动物 体细胞 细胞培养 卵供体动物 未受精卵 除去卵核 细胞融合 克隆胚胎 胚胎移植 无核卵子 代孕母亲 代孕母亲 基因组经过同源重组修饰的转基因克隆牛 细胞筛选 基因整合 目标基因 基因转移 同源重组 52 同源重组进行基因整合的机理 A B NeoR P Killing B A A B NeoR P 双交换 内源性酪蛋白基因 突变的酪蛋白基因 外源基因结构 抗新霉素的细胞系 群 53 目标基因 基因转染 药物筛选 怀孕产犊 核卵融合 胚胎移植 克隆胚胎 繁育扩群 转基因克隆牛基因高效表达 代孕母亲 工厂化生产牛群 市场销售 全球市场营销 体细胞 核移植 细胞培养 同源重组 依赖于基因组修饰的转基因克隆技术图示 54 55 Knock outTechnology 56 HOMOLOGOUSRECOMBINATION A B NeoR P Killing B A A B NeoR P Doublecrossover Endogenouslocus Mutatedlocus ForeignDNA Neomycinresistantcloningcellline 57 HOMOLOGOUSRECOMBINATION A B NeoR P Killing B A A B NeoR P Singlecrossover Endogenouslocus Mutatedlocus ForeignDNA Cellswillbekilledbytoxingene sproduct Killing B A Endogenouslocus 58 Inducibleexpressionsystem Tet onorTet off X 59 Cre LoxPsystem LoxP LoxP CreProtein LoxP 60 Integrationofmultiplecopies RNA mediatedDNAmethylation InsertionintohypermethylatedGenomicregions Transgenerecognition DNApairing DNA RNApairing Spreading of Methylationpattern Age Environmentalstress 61 Howtoovercome positionaleffect ChromosomeDNAloop Nuclearmatrixchannel ActivegenesattachedtomatrixchannelsthroughtheregulatorydomainsandDNApolII MatrixAttachmentRegion 62 LocusControlRegion Insulator 63 AnimalTransgenics Mammarybioreactor Pharmaceuticals Neutraceuticals Bio materials Bio cosmetics 64 国内外研究现状与趋势 体细胞克隆动物 65 国内外研究现状与趋势 PPL公司Knock out绵羊 66 PPL公司Knock out猪 67 核供体动物 体细胞 细胞培养 卵供体动物 未受精卵 除去卵核 细胞融合 克隆胚胎 胚胎移植 无核卵子 代孕母亲 代孕母亲 基因组经过同源重组修饰的转基因克隆牛 细胞筛选 基因整合 目标基因 基因转移 同源重组 利用同源重组进行基因组修饰的难点 长期培养 68 研究技术路线 体细胞克隆 细胞长期培养 细胞克隆筛选 基因的同源重组 转基因克隆 基因组修饰技术平台 69 研究方案和内容 化学去核法以使体细胞克隆操作简便 提高工作规模和克隆效率 70 研究方案和内容 双标记筛选已确定同源重组的细胞克隆 群 细胞筛选 同源重组 新霉素荧光GFP 克隆胚胎 荧光细胞 71 转有人mAAT基因的奶山羊 72 核供体动物 体细胞 细胞培养遗传修饰 卵供体动物 未受精卵 除去卵核 细胞融合 克隆胚胎 胚胎移植 无核卵子 代孕母亲 代孕母亲 与核供体遗传相同的克隆牛 73 AnimalTransgenics Xenotransplantation Organs GM cells Tissues Frogdevelopmentwithouthead 74 ImmunologicalBarriers Hyperacuterejection Rejectionmediatedbyantibody comple mentcomplexeswhichdamagestheendo thelialcellsofvascularinterityandkillingtheorganwithinminutesAcuterejection RejectionmediatedbyTcellswhichdamagethebloodvesselsanddestroyingtheorganwithindaysChronicrejection RejectionmediatedbyacompleximmuneProcess humoralimmunityandcell mediatedimmunity anddamagingtheorganintherangeofmanyyears 75 用于人体器官移植的动物器官 PPLInterim报告和NatureBiotechnology16 3 224 1998 76 美国D MD医药投资发展公司 美国等待器官移植的病人数量 1998年 77 Porcineendogenousretrovirusmayhurtthehumanwhenpigorganswastransplantedintothehuman WhetherpigpathogensWillinfecthumanwhoharboringapigorgansremainunknown 治疗型克隆技术将更具有挑战性和广泛应用前景 固体器官 60亿美元 年的美国市场 79 XenotransplatationpigsTheskinwasgraftedfromotherspecies 80 ProductionofBiosteelbyTgGoat 5mm 81 ThestrongestmaterialsintheWorld Spiderdraglinesilkiswidelyrecognizedasthestrongestmaterialknown 82 PersonalBallisticProtection superiorenergy to break mechanicalpropertieswithweight25 lighterthanaramid basedfibers MedicalMaterials highstrengthsuturesandprostheticdevices PersonalHealthcare cosmeticformulationtoprovidesupportandelasticitytoskin IndustrialComponent improvethestrengthprofileforautomotiveandmilitaryandaerospacecomponents PotentialApplicationsofBiosteelinFuture 83 SPIDERMAN USAARMY 84 USABiosteelProductionBasement Plattsbaerg NY 85 诊断 治疗人类疾病及新药筛选的转基因动物模型 基因过量的表达基因敲除 Knock out 或敲入 Knock in 病毒和其他病原的DNA插入诱变318knock out inmice47over expressionmice15virus inducedmice 18 25亿美元 年市场 86 TheR DofGlobalBiotechCompanyBasedonTransgenicPlatform TotalNumbersin1999 56 21inUSA theNorthAmerica 12inEU 13inAsia PacificIsland Thenumbersinstockmarket 10 5inUSAandCanada 4inEuropeancountries 1inAustralia Thepricerangedfrom7to158US ThecurrentsituationinChina 3 3 2pending 87 OxygentherapeuticalsBiopure Enzoycorp InsituEScellstherapyChiron BaxterInc 16 7billioninUSAbut5 8billioninbloodtransfusion 88 BIOPURE acinderalatechnology Hemopure animmediateoxygendelivermedicineformanydiseases clinicaltrialIIIfinished Oxyglobin anoxygentherapeuticalsforpetanimals 89 BiopureHeadquarterinBoston NASDAQ 22 5US pershare But300millionsspent100millioninhandforheadingtomarket 90 ANIMALCLONING ESCELLTECHNOLOGY 1997 1997 91 92 MilestoneofAnimalCloning 93 94 Micewereclonedinalargescaleby Honolulu technology 95 96 Collectingtissueandcellculture Petorfarmanimaltobecloned 97 CellsStorageforCloningtorelive 98 Manipulationofrecipientoocytes 99 NUCLEARTRANSFER 100 EmbryoTransfer 101 102 Clonedtransgeniccalvesproducedfromnonquiescentfetalfibroblasts CMV LacZ NeoR Transfection Neo resistant Nucleartransfer Embryotransfer Clonedcalves 103 CloningPandaandMammoth Rareintheworld Deadover12 000yrs 104 Cross speciesanimalcloning 105 CloningHumanorOrgan 106 Therapeuticalcloningprocedure 107 Thecellscanbeinducedanddifferentiatedtomanytypes 108 SomaticcellNucleartransfer Invitrofertilization Fetaltissue PatientorGreat man Therapeu